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본 실험에서는 항산화 활성과 미백 활성을 평가하기 위해 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl(DPPH), ascorbic acid, copper(Ⅱ) chloride, neocuproine, sodium carbonate, Folin-Ciocalteu phenol reagent, gallic acid, L-tyrosine, mushroom tyrosinase, arbutin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였으며 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Junsei chemical Co., Ltd.(Tokyo, Japan)에서 구매하였고 94.5% 에탄올은 Daejung(Seoul, Korea)에서 구매하였다.

본 연구에서는 대두 에탄올 추출물을 파이토알렉신(Gimhae, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 대두 에탄올 추출물을 카트리지 5 μm 폴리프로필렌 필터를 이용하여 여과하였으며 3 h 동안 환류 추출해 동결 건조하였다. 동결 건조한 시료는 —20℃에서 보관하며 이후 실험할 농도로 DMSO에 희석하여 사용하였다. 대두 에탄올 추출물은 GEE(Glycine max (L.) Merr ethanol extract)로 명명하였다.

2 mL 마이크로 튜브에 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도 시료 200 μL와 증류수를 1,000 μL 넣어주고 50%(v/v) Folin-Ciocalteu phenol reagent(FCP)를 100 μL 첨가한 후, 상온에서 5 min 동안 반응시켜 GEE의 환원력을 확인하였다. FCP는 필요한 양에 따라 증류수와 FCP를 1:1 비율로 계산하여 분주하기 직전 제조하였다. 5 min이 지나고 나면 증류수에 용해시킨 5%(w/v) Na₂CO₃ 용액을 200 μL 첨가하고 어두운 곳에서 1 h 동안 반응시킨 후 96-well plate에 200 μL씩 분주한 뒤 microplate reader(VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 gallic acid를 이용하여 표준 곡선을 작성하였으며 GEE의 총 페놀 함량은 작성한 표준 곡선수식인 y=0.0376x—0.0224에 대입하여 산출해 μg GAE/mL로 나타내었으며 표준 곡선의 R²값은 R²=0.9982의 결과값을 나타내었다.

대두 에탄올 추출물인 GEE의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 라디칼은 빛과 온도 등 외부 환경에 불안정하므로 94.5% 에탄올에 용해시켜 200 μM의 DPPH 라디칼 용액을 제조한 후 반응 전까지 호일에 감싸 0℃에서 안정화하였다. 96-well plate에 미리 제조해 둔 DPPH 라디칼 용액 190 μL와 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도 시료를 각각 10 μL씩 넣은 후, 빛을 차단하기 위해 96-well plate 전체에 호일을 씌우고 37℃ incubator에서 30 min 동안 반응시켜 517 nm에서 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군은 시료 대신에 시료의 용매인 DMSO를 10 μL 넣어주었으며 각 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 아래의 계산식을 사용하여 백분율로 나타내었다. 또한 양성대조군으로는 대표적인 항산화 물질인 ascorbic acid를 사용하였고 GEE와 같은 농도에서 비교하였다.

증류수에 CuCl₂를 용해시켜 1 mM CuCl₂ 용액을 제조하고 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)에 0.625 mM neocuproine을 용해하여 250 μM neocuproine 용액을 제조하였다. 96-well plate에 미리 제조해 둔 1 mM CuCl₂ 용액 20 μL와 250 μM neocuproine 용액 80 μL, 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4) 60 μL 그리고 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도 시료를 40 μL 넣어주었다. 그 후 실온에서 1 h 동안 반응시켜주고 반응이 끝나면 microplate reader(VersaMax Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 454 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신에 시료의 용매인 DMSO를 40 μL 첨가해 주었으며 양성 대조군으로는 앞 실험과 동일하게 ascorbic acid를 사용하였다.

대두 에탄올 추출물인 GEE의 미백 활성을 평가하기 위해 tyrosinase 저해 활성을 분석하였다. 0.1 M sodium phosphate buffer에 L-tyrosine을 용해하여 1.5 mM L-tyrosine을 제조한 후 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL 농도의 시료 20 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer 220 μL, 1.5 mM L-tyrosine 40 μL 그리고 1,500 U mushroom tyrosinase 20 μL를 첨가하여 37℃ incubator에서 15 min 동안 반응시켰다. 그 후 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용해 490 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군은 시료의 용매인 DMSO를 20 μL 첨가하였으며 또한 양성 대조군으로는 미백 성분으로 잘 알려진 arbutin을 사용하였고 시료와 같은 농도로 진행하였다. Tyrosinase 저해 활성은 GEE나 양성 대조군인 arbutin을 첨가한 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

모든 실험은 3회 반복하였으며, 모든 데이터는 평균±표준편차로 표현하였다. 데이터의 통계처리는 SPSS software(Ver.18, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석하였다. 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 통해 그룹 간의 유의성을 평가하였고, 사후검증은 Duncan’s test를 이용하여 신뢰수준 p<0.05에서 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다.

많은 페놀계 물질들은 다양한 생리활성을 가지고 있기 때문에 기능성 식품의 주요 성분으로 주목받고 있다(Whang HJ 등 2001). 페놀 화합물에 존재하는 hydroxyl group은 자유라디칼의 중화시키는 수소이온을 공여하는 능력이 있으며, 폴리페놀의 함량이 증가할수록 항산화력이 증가하는 경향을 보인다(Imai J 등 1994; Halliwell B 등 1995). 이를 통해 총 페놀 함량을 측정하여 추출물의 항산화능을 유추할 수 있다. GEE의 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과는 Fig. 1에 나타내었으며 시료의 표준물질인 gallic acid의 양으로 환산하여 나타내었다. GEE는 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도로 처리하였으며 총 페놀 함량은 0.00, 0.59, 1.20, 2.12, 3.65 및 6.09 μg GAE/mL로 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 시료의 폴리페놀 함량은 일반적으로 품종, 숙성시기, 껍질의 색 등에 따라 큰 차이를 나타내기도 한다(Rice-Evans CA 등 1997; Díaz-Mula HM 등 2009). 페놀 화합물 함량과 항산화 활성간의 상호작용에 대한 많은 연구들에서 알 수 있듯이 식물체가 지니고 있는 페놀 화합물의 함량을 조사함으로써 천연 추출물의 항산화 활성을 탐색하는 일차적인 자료가 될 수 있을 것으로 판단되며(Boo HO 등 2009), 곡물에 함유된 페놀 성분은 산화방지 능력과 매우 높은 상관성을 가지기 때문에(Lee SC 등 2006; Kanatt SR 등 2011) 본 실험 결과는 GEE의 항산화 활성의 기초 자료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 대두에 함유된 페놀성 화합물에는 플라보노이드, 이소플라본, 페놀산, 리그난 등이 있다고 보고되어진다(Kurzer MS & Xu X 1997).

Fig. 1. 
The total phenolic content of GEE was calculated as gallic acid equivalent (GAE).

The total phenol of GEE was measured at various concentrations (10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL). The total phenolic content of GEE was increased concentration-dependently. Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.

일반적으로 특정 물질에 대한 항산화 활성을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으나 그 중에서 DPPH 라디칼 소거 활성법은 비교적 간단하면서도 대량으로 측정이 가능한 방법이다(Choi KM 등 2005). DPPH 라디칼 소거능은 화학적으로 유도되는 organic nitrogen radical로 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 매우 빠른 속도로 전자를 공여받아 안정한 화합물인 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazin으로 전환되는데, 이때 짙은 보라색이 엷어지는 특성이 있다(Thongchai W 등 2009). DPPH assay에 따른 free radical 소거능은 안정한 상태의 활성 산소종을 이용하여 항산화력을 검증하는 데 널리 이용하고 있다(Lee MH & Kan SM 2018). 대두 에탄올 추출물 GEE의 항산화 활성을 측정하기 위한 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과는 Fig. 2와 같다. GEE는 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도로 처리하였고 양성대조군으로는 잘 알려진 항산화제인 ascorbic acid를 이용하여 같은 농도에서 비교하였다. GEE는 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL 각각의 농도에서 5.56%, 8.92%, 11.56%, 16.54%, 25.50% 및 40.24%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었으며 양성 대조군인 ascorbic acid는 55.02%, 98.27%, 98.41%, 98.58%, 98.59% 및 99.97%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. GEE는 ascorbic acid에 비해서는 비교적 낮은 소거능을 보였지만, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 대두의 여러 가지 생리활성을 설명하는 기작의 하나로 항산화 효과가 거론되고 있으며(Wel H 등 1995; Giles D & Wei H 1997), 대두에서 항산화 효과를 나타내는 것으로 알려진 물질로는 genestein과 daidzein을 포함하는 isoflavones 및 phenolic acids, 토코페롤, 피트산, 트립신 저해제와 아미노산 및 peptide들이 관여하는 것으로 알려져 있으며(Hayes RE 등 1997), 대두에는 이소플라본, 사포닌, 식이섬유, 레시틴 등과 영양물질인 단백질, 지방, 탄수화물 등 생리활성 물질이 많이 함유되어 있기 때문에(Lim JM 등 2020) 항산화 활성과 대두 추출물의 생리활성 성분에 대한 연관성에 대하여 추가적인 분석이 추후 요구된다.

Fig. 2. 
Antioxidant activity of GEE was examined by DPPH radical scavenging assay.

Ascorbic acid was used as a positive control. The DPPH radical scavenging activity of GEE and ascorbic acid were evaluated at various concentrations (10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL). GEE was increased in a concentration-dependent. Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.

대두 에탄올 추출물(GEE)의 환원력을 측정하기 위해 copper reduction assay를 실시하였다. 환원력은 다양한 항산화 활성 중 활성산소종과 유리기에 전자를 공여하는 능력이다(Oyaizu M 1986). 환원력에서의 흡광도 수치는 그 자체가 그 시료의 환원력을 나타내며, 높은 환원력을 가지는 물질은 흡광도의 수치가 높게 나타나고(Tanaka M 등 1988), 환원력은 시료가 항산화제로서 사용될 수 있음을 나타내는 지표이기도 하다(Meir S 등 1995). 환원력이 클수록 과산화 지질 및 활성산소를 제거하여 성인병을 예방하는 효과가 있기 때문에 환원력을 유지하는 능력이 클수록 그 이용 가치가 크다(Choi YM 등 2007). GEE의 환원력 측정 결과는 Fig. 3에 나타내었다. GEE의 환원력을 측정한 결과, 농도가 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL로 증가할수록 환원력 역시 0.82, 3.51, 7.15, 11.53, 16.55 및 20.82 μM로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 양성대조군인 ascorbic acid는 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL로 처리하였을 때 23.99, 33.41, 41.26, 41.60, 41.90 및 41.41 μM만큼 Cu²⁺을 Cu¹⁺로 환원시키는 것을 확인할 수 있었다. Choi SY 등(2006)의 연구를 보면 DPPH radical 소거능과 환원력은 밀접한 관계를 가지고 있으며, 총 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 능이 높은 것을 알 수 있다. 본 실험에서는 대두 에탄올 추출물의 농도가 증가될수록 DPPH 라디칼 소거 활성능이 좋았고 환원력도 같은 경향을 보였으며 이를 통해 항산화 활성이 우수함을 확인하였다. 최근에는 대두의 라디칼 소거활성, 환원력 등의 항산화 활성에 관한 연구도 활발히 진행되고 있으며(Prakash D 등 2007; Xu B & Chang SK 2008; Szymczak G 등 2017), 대두에는 각종 페놀 화합물과 플라보노이드의 일종인 이소플라본이 많이 함유되어 있어 이러한 물질들이 환원력을 나타내는 항산화 활성을 나타낸다고 추정된다(Park JW 등 2007).

Fig. 3. 
Copper reduction activity of GEE.

Ascorbic acid was used as a positive control. Copper reduction activity of GEE and ascorbic acid were evaluated at various concentrations (10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL). GEE was confirmed to inhibit copper ions in a concentration-dependently. Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.

GEE의 멜라닌 생합성을 조절하는 효소인 tyrosinase의 직접적인 영향을 확인하기 위해 mushroom tyrosinase의 저해 활성능을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. GEE를 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도로 제조하여 실험하였으며 양성 대조군으로는 미백 물질로 잘 알려진 arbutin을 사용하였다. 실험 결과 GEE는 4.96%, 8.34%, 6.14%, 5.08%, 7.28% 및 9.80%의 tyrosinase 저해능을 보였으며 arbutin은 8.34%, 27.89%, 41.90%, 60.79%, 77.62% 및 97.25%의 tyrosinase 저해능을 보였다. Melanogenesis는 여러 단계의 연속적인 반응을 통하여 멜라닌을 생성하며 tyrosinase가 첫 단계를 진행하는 가장 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있다. Tyrosinase는 polyphenol oxidase라고도 불리며 멜라닌이 생성되는 미생물, 동물 및 식물에 다양하게 분포하고 있다(Kim SH 등 2013). Tyrosinase는 tyrosine을 산화시켜 기질인 L-3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA) 및 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로서 작용함과 동시에 DOPA chrome에서 유도된 5,6-dihydroxyindole(DHI)이 indole-5,6-quinone 변환과정에 관여하여 melanin 중합체를 합성하는 데 중요한 효소로 작용한다(Marmol V & Beermann F 1996). 대두는 세포 내 멜라닌 생성을 억제하는데 효과적이며 미백 효과가 우수하다고 보고된 바 있으며(Yoo JK 등 2013), 대두의 생리활성물질 중 하나인 isoflavone의 aglycone 형태인 genistein과 미백 효과의 관계에 대한 연구인 Yang ES 등(2008)은 멜라닌 세포에 genistein을 처리한 후 tyrosinase 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 tyrosinase의 활성이 감소했다고 보고된 바 있다. 또한 대두의 이소플라본 특히 daidzein과 genistein의 미백 기능은 여러 연구에 의해 오래전부터 밝혀진 바 있으며(Paine C 등 2001; Huang ZR 등 2008; Leyden J & Wallo W 2011), 본 실험에서 GEE는 arbutin과 비교하여 현저히 낮은 저해능을 보여 추후 연구에서 세포를 이용한 미백 실험을 진행하여 GEE의 미백 활성을 확인할 필요가 있다고 판단된다.

Fig. 4. 
Tyrosinase inhibitory activity of GEE.

The tyrosinase inhibitory activities of GEE was evaluated at various concentrations (10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL). Arbutin was used as a positive control. The concentration-dependent tyrosinase activity of Arbutin used as a positive control group was suppressed. Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.