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본 실험에서 쌍별귀뚜라미와 이온화 칼슘 수용액은 ㈜현대바이오(Suwon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 분쇄한 쌍별귀뚜라미 50 g에 증류수와 이온화 칼슘 수용액에 각각 1 L 씩 가하여 110℃에서 1 hr 동안 열수 추출하고 동결건조(PVTFD-10R, Ilshinbiobase, Dongducheon, Korea) 시킨 후 —20℃에 보관하며, 이후 분석에 사용하였다. 증류수에 추출한 쌍별귀뚜라미는 WEG(Water extract of Gryllus bimaculatus), 이온화 칼슘 수용액에 추출한 쌍별귀뚜라미는 IEG(Ionized calcium solution extract of Gryllus bimaculatus)로 명명하였다.

쌍별귀뚜라미 50 g을 증류수와 이온화 칼슘 수용액에 각각 1 L씩 가하여 110℃에서 1 hr 동안 열수 추출하고 동결건조(PVTFD-10R, Ilshinbiobase, Dongducheon, Korea) 시킨 후, 무게를 측정하였다. 추출 수율(yield)은 백분율(%)로 표시하였다(Table 1).

쌍별귀뚜라미 추출물 WEG와 IEG의 항산화 활성은 1.1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 94% 에탄올에 용해한 200 μM의 DPPH 190 μL에 증류수에 희석한 귀뚜라미 시료를 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL로 단계 희석하여 각각 10 μL을 넣고 37℃의 incubator에서 30 min 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신에 에탄올에 용해한 200 μM의 DPPH 190 μL에 증류수 10 μL를 첨가하였고 DPPH 라디칼 소거능은 아래의 방법으로 계산하였다. 양성대조군으로는 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid(vitamin C)를 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL의 농도로 단계 희석하여 비교하였다.

쌍별귀뚜라미 추출물 WEG와 IEG의 환원력 측정을 위해 copper ion reduction 실험을 실시하였다. 증류수에 녹인 100 μM의 CuCl₂ 용액 20 μL와 250 μM의 neocuproine 80 μL, 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4) 60 μL 그리고 쌍별귀뚜라미 추출물을 단계 희석한 시료 40 μL을 96-well plate에 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL 순서대로 분주한 후 실온에서 1 hr 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 454 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 100 μM CuCl₂ 용액 20 μL와 250 μM 농도의 neocuproine 80 μL와 10 mM 농도의 potassium phosphate buffer 60 μL 그리고 CuCl₂를 용해시킨 증류수 40 μL를 첨가하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였으며, 결과 값은 Cu⁺¹/neocuproine의 extinction coefficient(7.95 × 10³ M^-1cm^-1)를 사용하여 454 nm 흡광도로부터 계산된 Cu⁺¹의 농도로서 환원력을 표시하였다.

본 실험에 사용된 인간 간암 세포주인 HepG2 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받아 사용하였다. HepG2 세포는 10%(v/v)의 fetal bovine serum(FBS)과 penicillin-streptomycin이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지에 배양하였으며, 5%의 CO₂, 37℃의 환경에서 이틀에 한 번씩 FBS-DMEM 배지를 교체해 주었다.

에탄올에 의해 유도된 HepG2 세포에 대한 쌍별귀뚜라미 추출물의 간 보호 효과를 확인하기 위해 200 μg/mL 농도의 추출물을 전처리한 후 7.5%(v/v) 에탄올을 처리하여 세포 생존율을 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 실시하였다. 쌍별귀뚜라미 추출물을 포함한 FBS-DMEM은 24 hr 처리 후 제거하였다. 그 후 24 hr 동안 7.5%(v/v)의 에탄올을 첨가한 DMEM 배지를 처리하였다. Ethanol-DEME 배지를 제거하고 200 μg/mL의 MTT-media(DMEM and MTT reagent dissolved in PBS, pH 7.4)를 첨가하여 1 hr 동안 처리하였다. MTT-media를 제거하고 용해되지 않는 MTT formazan은 700 μL의 DMSO를 가하여 녹여준 다음 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 570 nm의 흡광도로 측정하였다.

에탄올에 의해 유도된 HepG2 세포에 대한 쌍별귀뚜라미 추출물의 간 보호 효과를 확인하기 위해 200 μg/mL 농도의 추출물과 7.5%(v/v) 에탄올을 동시 처리하여 세포 생존율을 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 쌍별귀뚜라미 추출물을 포함한 FBS-DMEM과 7.5%(v/v)의 에탄올을 함께 처리하였으며, 24 hr 후 DEME 배지를 제거하고, 200 μg/mL MTT-media를 첨가하여 1 hr 동안 처리하였다. MTT-media를 제거하고 용해되지 않는 MTT formazan은 700 μL DMSO를 가하여 녹여준 다음, microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 570 nm의 흡광도로 측정하였다.

모든 데이터는 평균±표준편차로 표현하였다. 통계처리는 Statistical Package for Social Science(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였으며, 각 항목은 일원 배치 분산 분석(one-way ANOVA) 하였고, 각 구간의 유의성 차이는 Duncan’s test 방법에 따라 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다(p<0.05).

DPPH는 실온에서 안정하고 수용성 용매가 아닌 유기 용매에서 용해되며, 항산화 물질이 존재할 때 보라색이 노란색으로 옅어진다. DPPH 라디칼 소거 활성 측정법은 천연소재의 항산화 활성 측정에 적합하고 간단하며, 재현성이 좋아 항산화 활성 측정에 가장 많이 이용되는 실험 방법 중 하나이다(Abdalla AE & Roozen JP 1999). 쌍별귀뚜라미를 증류수와 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 추출물인 WEG와 IEG의 항산화 활성을 평가하고 비교하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가 하였다. WEG와 IEG는 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL의 농도로 처리하였으며 양성대조군으로는 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid를 사용하였다(Fig. 1). 증류수로 추출한 WEG는 각각 7.62%, 31.85%, 42.81%, 53.09% 그리고 63.35%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다. 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 IEG는 각각 4.82%, 16.41%, 28.23%, 37.87% 그리고 45.74%로 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈으나 증류수로 추출한 WEG보다 낮은 소거능을 나타냈다. 양성대조군인 ascorbic acid를 각각 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL의 농도로 시험했을 때 19.22%, 55.01%, 66.85%, 75.37% 그리고 80.30%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈다. 양성대조군 ascorbic acid의 50 μg/mL의 농도와 WEG의 200 μg/mL의 농도에서 DPPH 라디칼이 유사한 정도의 소거 활성을 나타내었다. 현재 증류수와 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 쌍별귀뚜라미의 항산화 활성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 그러나 다른 종류의 식용곤충인 갈색거저리 유충 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과 1, 5 그리고 10 mg/mL에서 17.22%, 66.79%, 그리고 81.17%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다(Baek MH 등 2017). WEG와 IEG의 100 μg/mL의 농도에서는 각각 42.81%와 28.23%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈고 갈색거저리 유충 추출물의 1 mg/mL에서는 17.22%로 WEG와 IEG보다 갈색거저리 유충 추출물의 농도가 10배 더 높지만 DPPH 라디칼 소거 활성은 WEG가 2배 이상, IEG는 약 1.6배 이상 높았음을 확인할 수 있었다. 따라서 쌍별귀뚜라미 추출물인 WEG와 IEG는 갈색거저리 유충 추출물보다 더 높은 수준의 DPPH 라디칼 소거능을 보이므로 자유 라디칼 제거에 의한 높은 항산화 활성을 기대할 수 있다. 선행연구(Kim SH 등 2020)에서 쌍별귀뚜라미는 아미노산의 조성이 우수하고, 분지아미노산도 함유되어 있으며, 지방 함량이 낮고, 항산화 활성이 높아 근감소 억제, 항산화 및 뷰티 푸드 관련 식품소재나 식품으로서의 활용가능성이 높다고 보고하였다.

Fig. 1. 
The DPPH radical scavenging activities of Gryllus bimaculatus extracts.

Corresponding letters indicate significant differences among tested filtered water extracts and ionized calcium solution extracts of Gryllus bimaculatus based on ANOVA with Duncan’s multiple range test (p<0.05). Ascorbic acid (Vit. C) was used as a positive control in this assay.WEG: Water extract of Gryllus bimaculatus, IEG: Ionized calcium water extract of Gryllus bimaculatus.

Copper reduction assay는 환원제에 의해서 Cu²⁺을 Cu¹⁺으로 환원되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법이다(Rhim TJ 등 2012). 환원력 측정은 항산화 활성과 밀접한 관련이 있는 항산화력 측정 방법으로 항산화 활성은 환원력에 의한 자유 라디칼 소거능으로 나타낸다(Siddhuraju P 등 2002). 항산화 물질의 환원제는 수소 원자를 제공하여 자유 라디칼 연쇄반응을 중단시킴으로써 환원력을 제공한다(Kumaran A & Karunakaran RJ 2007). 쌍별귀뚜라미 추출물들이 항산화 능력이 있는지 알아보기 위해 환원력을 측정하는 실험인 copper reduction assay를 실시하였다. 열수 추출 시 사용한 추출 용매를 증류수와 이온화 칼슘 수용액으로 하여 이들의 차이와 환원력을 평가하였다(Fig. 2). WEG와 IEG를 각각 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL의 농도로 하여 실험하였을 때, 증류수로 추출한 WEG는 3.54, 16.55, 31.22, 40.49 그리고 40.39 μM(copper(I) ion)이고 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 IEG는 2.74, 13.55, 26.29, 41.46, 43.78 μM(copper(I) ion)으로 Cu²⁺을 Cu¹⁺으로 환원하였다. 증류수로 추출한 WEG와 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 IEG를 비교하였을 때, 추출 용매가 다르기 때문에 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 IEG가 Cu²⁺을 Cu¹⁺으로 환원시키는 환원력이 증류수로 추출한 WEG보다 더 높은 수준의 환원력을 나타냈다. 따라서 copper reduction assay는 추출 시 사용된 추출 용매가 이온화 칼슘 수용액일 때 Cu²⁺을 Cu¹⁺으로 환원시키는 환원력이 더 높았고, WEG와 IEG 모두 농도 의존적으로 Cu²⁺을 Cu¹⁺으로 환원시켰다. 양성대조군인 ascorbic acid는 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL의 농도에서 실험하였을 때 1.02, 2.97, 5.90, 12.13 그리고 23.57 μM(copper(I) ion)로 구리이온을 농도 의존적으로 환원시켰다. DPPH 라디칼 소거능과 마찬가지로 증류수와 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 쌍별귀뚜라미의 항산화 활성에 대한 연구가 아직 미흡하다. 게다가 이온화 칼슘 수용액을 활용한 연구는 보고된 바 없다. 구리 환원력에 의한 항산화 반응은 수소 원자를 제공하는 유리라디칼의 연쇄반응으로 환원력의 세기가 높을수록 항산화 활성이 높다고 볼 수 있다(Sa YJ 등 2010). 이러한 결과는 쌍별귀뚜라미 추출물이 전자 및 수소의 전이 활성을 통해 자유 라디칼을 소거할 수 있다는 것을 의미하며 이는 천연 항산화 물질로서 활용될 전망이 크다.

Fig. 2. 
The reduction potential of Gryllus bimaculatus extracts.

Corresponding letters indicate significant differences among tested filtered water extracts and ionized calcium solution extracts of Gryllus bimaculatus based on ANOVA with Duncan’s multiple range test (p<0.05). Ascorbic acid (Vit. C) was used as a positive control in this assay.WEG: Water extract of Gryllus bimaculatus, IEG: Ionized calcium water extract of Gryllus bimaculatus.

쌍별귀뚜라미 추출물인 WEG와 IEG가 HepG2 세포에서 독성을 나타내는지 알아보기 위해 MTT assay를 실시하여 세포 생존율을 분석하였다(Fig. 3). 아무것도 처리하지 않은 대조군과 WEG와 IEG를 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL의 농도로 24 hr 처리하였을 때, WEG를 처리한 HepG2 세포의 생존율은 각각 107.55%, 105.27%, 99.51%, 105.15% 그리고 104.52%이고, IEG는 100.41%, 91.84%, 96.02%, 97.12% 그리고 107.52%였다. 결과적으로 400 μg/mL 이하의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타냈으므로, 이후 실험에서는 200 μg/mL의 농도의 WEG와 IEG를 사용하였다.

Fig. 3. 
Effect of Gryllus bimaculatus extracts on the cell viability of HepG2 cells.

Corresponding letters indicate significant differences between control and Gryllus bimaculatus extracts by ANOVA with Duncan’s multiple range test (p<0.05).WEG: Water extract of Gryllus bimaculatus, IEG: Ionized calcium water extract of Gryllus bimaculatus.

에탄올로 유도한 HepG2 세포에서 쌍별귀뚜라미 추출물 전처리의 간세포 보호 효과를 알아보기 위해 HepG2 세포에 WEG와 IEG를 200 μg/mL의 농도로 24 hr 동안 전처리한 후 7.5%(v/v) 에탄올을 24 hr 동안 처리하여 세포 생존율을 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다(Fig. 4). 아무것도 처리하지 않은 대조군과 7.5%(v/v) 에탄올을 24 hr 처리하여 MTT assay를 실시하였을 때, 대조군 대비 7.5%(v/v) 에탄올 처리군에서 세포사멸이 일어났음을 확인할 수 있다. 또 7.5%(v/v) 에탄올을 24 hr 동안 처리한 그룹과 WEG와 IEG를 200 μg/mL를 전처리 후 7.5%(v/v) 에탄올을 처리한 그룹을 MTT assay를 실시했다. 7.5%(v/v) 에탄올 처리 그룹은 11.47%의 세포 생존율을 보였고, WEG와 IEG로 전처리하고 24 hr 후에 에탄올을 처리한 그룹은 20.35%와 27.86%의 세포 생존율을 나타냈다. 이러한 결과는 쌍별귀뚜라미 추출물은 간세포 보호 효과가 있음을 의미하고, 특히 이온화 칼슘 수용액으로 추출한 IEG를 전처리 했을 때, 간세포를 더 효과적으로 보호했음을 확인할 수 있었다. 이전의 연구에서 식용곤충인 갈색거저리 발효 추출물이 사염화탄소로 인해 낮아진 SOD, GSH-Px 및 GST 등의 항산화 효소를 활성화하여 간세포를 보호한다는 보고가 있었으며, 쌍별귀뚜라미 추출물 또한 이에 대한 추가 연구가 요구된다.

Fig. 4. 
Effect of pre-treatment Gryllus bimaculatus extracts and ethanol on the cell viability of HepG2 cells.

Corresponding letters indicate significant differences between control and Gryllus bimaculatus extracts by ANOVA with Duncan’s multiple range test (p<0.05).WEG: Water extract of Gryllus bimaculatus, IEG: Ionized calcium water extract of Gryllus bimaculatus.

다양한 농도의 에탄올에 대한 세포 생존율을 확인하기 위해 HepG2 세포를 대상으로 MTT assay를 실시하였다(Fig. 5). 에탄올의 농도를 0%, 1%, 2.5%, 7.5% 그리고 10%(v/v)로 24 hr 처리하였을 때, HepG2 세포의 생존율은 각각 99.14%, 93.58%, 92.48%, 83.67% 그리고 4.68%였다. 2.5%, 7.5% 그리고 10%(v/v) 농도의 에탄올에서 유의적인 세포독성을 나타냈다. 따라서 추후 실험은 7.5%(v/v) 농도의 에탄올을 선택하여 사용하였다.

Fig. 5. 
Effect of ethanol on the cell cytotoxicity of HepG2 cells.

Corresponding letters indicate significant differences between control and ethanol treatment by ANOVA with Duncan’s multiple range test (p<0.05).WEG: Water extract of Gryllus bimaculatus, IEG: Ionized calcium water extract of Gryllus bimaculatus.

HepG2 세포에서 에탄올과 병행 처리한 쌍별귀뚜라미 추출물의 간세포 보호 효과를 알아보기 위해 HepG2 세포에 200 μg/mL의 농도의 WEG와 IEG와 7.5%(v/v) 에탄올을 24 hr 동안 처리하여 MTT assay를 실시하였다(Fig. 6). 아무것도 처리하지 않은 대조군과 7.5%(v/v) 에탄올만 24 hr 처리하여 MTT assay를 실시하였을 때 대조군 대비 7.5%(v/v) 에탄올 처리군에서 세포사멸이 일어났음을 확인할 수 있다. 또 7.5%(v/v) 에탄올만 24 hr 처리한 그룹과 200 μg/mL의 WEG와 IEG와 7.5%(v/v) 에탄올을 함께 처리한 그룹을 MTT assay를 실시하였다. 7.5%(v/v) 에탄올 처리 그룹은 53.17%의 세포 생존율을 보였고, WEG, IEG와 에탄올을 함께 처리한 그룹은 73.75%와 65.14%의 세포 생존율을 나타냈다. 선행연구(Sim Y 등 2020)에서 식용곤충인 갈색거저리와 동애 등에 유충 오일을 처리한 후 장내독소 및 염증인자인 TNF-α의 발현이 감소하였다고 보고되었으며, 쌍별귀뚜라미 분말과 분말 단백질 추출물의 발린, 루신, 이소루신 등의 아미노산 영양성분으로 인해 항산화 활성에 기여한다는 보고가 있었다(Kim SH 등 2020). 이러한 결과는 쌍별귀뚜라미 추출물과 에탄올을 동시 처리했을 때, 간세포 보호 효과가 있다는 것을 나타낸다. 또한 에탄올과 증류수로 추출한 WEG를 동시 처리했을 때, 에탄올만 처리한 군과의 유의적인 차이가 있음을 확인하였으므로 쌍별귀뚜라미 추출물은 간세포 보호에 효과가 있다고 사료된다.

Fig. 6. 
Effect of co-treatment Gryllus bimaculatus extracts and ethanol on the cell viability of HepG2 cells.

Corresponding letters indicate significant differences between control and Gryllus bimaculatus extracts by ANOVA with Duncan’s multiple range test (p<0.05).WEG: Water extract of Gryllus bimaculatus, IEG: Ionized calcium water extract of Gryllus bimaculatus.