블랙커런트는 경상북도 상주시에 위치한 농장에서 생과를 구매하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 시약 중 DPPH, ABTS, 2,4,6-tris(2pyridyl)-s-triazine(TPTZ), L-ascorbic acid, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, quercetin, rutin, vanillic acid, caffeic acid는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, myricetin은 Tokyo Chemical Industry Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

블랙커런트 열수 추출물(WBC)은 블랙커런트 70 g에 증류수 700 mL를 가하고, 60℃의 항온수조에서 100 rpm의 속도로 교반하며, 12시간 동안 추출한 후 여과지(Toyo No. 2, Advantec. Itami, Japan)로 여과하였다. 여과액은 감압농축기(LABOROTA 4000-efficient, Heidolph Instruments GmbH & Co, Walpersdorfer, German)를 이용하여 농축한 뒤 동결건조기(JP/VD-400F, TIETECH Co, Nagoya, Japan)를 이용하여 동결건조하였다. 블랙커런트 에탄올 추출물(EBC)은 블랙커런트 70 g에 70% 에탄올 700 mL를 가하여 25℃, 100 rpm의 조건으로 12시간 동안 추출 후 여과지로 여과하고 농축한 뒤 동결건조하여 제조하였으며, 제조한 추출물은 —18℃에서 냉동보관을 하였다.

블랙커런트 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법(Fellegrini N 등 1999)에 따라 측정하였다. 시료 1 mL와 증류수 5 mL를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu 시약 0.5 mL를 첨가하고 혼합한 뒤 8분간 방치하였다. 여기에 7% Na₂CO₃ 10mL를 첨가하여 혼합액의 최종 부피가 25 mL가 되도록 증류수로 채우고, 암소에서 2시간 방치한 후 UV/Vis spectrophotometer(UV 1800, Shimadzu Co. Kyoto, Japan)로 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 시료 g당 gallic acid mg 당량(mg GAE/g)으로 표시하였으며, 3회 반복하여 측정한 후 평균값으로 나타내었다.

블랙커런트 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정은 Moreno MI 등(2000)의 방법에 따라 측정하였다. 시험관에 80% ethanol 4.3 mL와 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 Maqueous potassium acetate 0.1 mL를 넣어 혼합한 후 시료 0.5mL를 첨가하고, 실온에서 40분간 방치한 뒤 510 nm에서 UV/Vis spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 하여 시료 g당 quercetin mg 당량(mg QE/g)으로 구하였으며, 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다.

블랙커런트 추출물의 총 비타민 C 함량은 Korean Food Standards Codex(Ministry of food and drug safety 2018)에 제시된 2,4-dinitrophenylhydrazine(DNPH)에 의한 정량법에 따라 측정하였다. 시료량과 metaphosphoric acid-acetic acid를 동량으로 혼합한 후, 혼합한 시료 25 g을 증류수와 1:1 비율로 희석한 metaphosphoric acid-acetic acid 100 mL에 용해한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액 2 mL에 0.2% indophenol 용액을 적색이 나타나도록 3방울 첨가하고, metaphosphoric acid-thiourea 용액 2 mL와 DNPH 1 mL를 가하여 37℃ 항온수조에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후, 얼음물에 담가 냉각하면서 85% H₂SO₄ 5 mL를 천천히 가하여 1분간 반응시키고, 실온에서 40분간 방치한 뒤 UV/Vis spectrophotometer로 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 L-ascorbic acid를 이용하여 위와 같은 방법으로 검정곡선을 작성한 후 시료의 흡광도 값을 대입하여 검량선 대응값을 구하고 아래의 식을 이용하여 시료 중 총 비타민 C 함량을 계산하였다.

c: 검량선에 대입한 대응값(μg/mL)

w: metaphosphoric acid-acetic acid와 혼합된 시료(g)

블랙커런트 추출물의 페놀성 화합물의 함량을 분석하기 위하여 rutin, myricetin, quercetin, caffeic acid, gallic acid, vanillic acid를 메탄올에 1 mg/mL의 농도로 용해하여 표준물질로 사용하였다. 추출물은 10 mg을 증류수 3 mL에 혼합하여 현탁액을 조제한 다음, 0.45 μm syringe filter로 여과한 것을 HPLC(Prominence, Shimadzu Co. Kyoto, Japan)를 이용하여 Table 1의 조건으로 분석하였고, 데이터 수집 및 분석은 Shimadzu Class-VP version 6.14 SP1 software를 이용하였다.

DPPH radical 소거율은 Blois MS(1958)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1 mL와 7.5×10^—5 M DPPH 용액 2 mL를 혼합하여 37℃ 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거율은 아래 식을 이용하여 계산하였으며, 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다.

ABTS radical 소거율은 Re R 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. 시약은 2.45 mM의 potassium persulfate와 7 mM의 ABTS 용액을 1:1로 넣고 voltex mixwer를 이용하여 혼합하고 암소에서 12시간 반응시킨 뒤, 5 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 이용하여 413 nm에서 흡광도가 0.7∼0.8이 되도록 희석하였다. 희석시킨 ABTS 용액 4 mL와 시료 0.04mL를 혼합하여 30분간 반응시킨 후 UV/Vis spectrophotometer로 413 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거율은 아래의 식을 이용하여 계산하였으며, 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다.

FRAP 분석은 Benzie-iris FF & Strain JJ(1996)의 방법을 이용하였다. 시약은 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6)와 40 mM HCl에 용해한 10 mM의 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ)에 20 mM FeCl₃·6H₂O를 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 제조하였다. 시약과 시료를 7:1(v/v) 비율로 혼합한 후 UV/Vis spectrophotometer로 593 nm에서 흡광도를 측정였고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후 흡광도를 한 번 더 측정하였다. 시료의 환원력은 FeSO₄·7H2O를 표준물질로 작성한 검정곡선을 이용하여 FeSO₄ eqM로 구하였으며, 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다.

본 실험을 통해 얻은 결과들은 IBM SPSS statistics(version 25) program을 이용하여 t-test 및 분산분석(ANOVA)을 실시하여 분석하였고, 각 시료간 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하여 실시하였다.

블랙커런트 추출물의 추출 수율을 측정한 결과, 블랙커런트 열수 추출물(WBC)의 추출 수율은 12.12%로 나타났으며, 블랙커런트 에탄올 추출물(EBC)의 추출 수율은 11.16%로 나타났다(Table 2). Hong SJ(2017)의 연구에서 블랙커런트를 증류수와 80% 에탄올로 추출한 추출물의 수율이 각각 8.4%와 10.3%라고 보고되어 본 연구의 블랙커런트 추출물 수율이 좀 더 높게 나타났다. 이와 같이 블랙커런트 추출물의 수율이 차이가 나타나는 것은 추출물의 고형분 함량이 추출 시간, 추출 온도, 추출 횟수, 추출 용매의 극성 등에 따라 영향을 받기 때문으로 생각된다(Jeong HJ 등 2010).

WBC 및 EBC에 대한 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 Table 2에 제시된 바와 같이 총 폴리페놀 함량은 WBC가 30.22 mg GAE/g, EBC는 38.24 mg GAE/g으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 WBC가 21.20 mg QE/g, EBC는 40.86 mg QE/g으로 나타났다. 국내에서 재배된 오디의 열수 추출물을 연구한 Park HM 등(2012)에 의하면 오디 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량은 11.99 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 6.32 mg QE/g이었으며, 제주산 블루베리와 상동열매 추출물을 연구한 Ko GA 등(2017)에 따르면 블루베리 추출물의 총 폴리페놀 함량은 1.13 mg GAE/g, 상동열매 추출물의 총 폴리페놀 함량은 4.19 mg GAE/g이었다. 또한 아사이베리 증류수 추출물의 총 플라보노이드 함량이 4.50 mg QE/g으로 보고되어(Jang JY & Ko KS 2015) 본 연구의 WBC 및 EBC가 이 선행 연구들에서 보고된 다른 베리류에 비해 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 연구에서 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 WBC보다 EBC에 더 많이 함유되어 있는 것으로 분석되었는데, 블랙커런트 열매의 열수 및 에탄올 추출물을 연구한 Hong SJ(2017)에서도 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량은 202.1 mg/g, 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 238.3 mg/g으로 나타나 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 이와 같이 WBC에 비해 EBC의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 것은 에탄올 같이 극성을 띄고 있는 용매로 추출할 때 폴리페놀과 플라보노이드가 더 용이하게 추출되기 때문으로 사료된다(Kim SY 등 2014; Kim DS 등 2018).

WBC 및 EBC의 총 비타민 C 함량을 DNPH에 의한 정량법을 이용하여 측정한 결과는 Table 2와 같다. 총 비타민 C 함량은 WBC 39.95 mg/100 g, EBC 94.02 mg/100 g으로 분석되었으며, EBC가 WBC보다 더 많은 총 비타민 C를 함유하고 있는 것으로 나타났다. 5종류 베리의 비타민 C 함량을 측정한 Kim YR & Kim AJ(2020) 연구에서 아로니아는 15.06 mg/100 g, 블루베리는 0.35 mg/100 g, 블랙베리는 25.32 mg/100 g, 체리는 6.28 mg/100 g, 복분자는 0.30 mg/100 g의 총 비타민 C를 함유하고 있다고 보고하여, 본 연구의 블랙커런트 추출물이 이들 베리류에 비해 비타민 C의 함량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 EBC가 WBC보다 비타민 C 함량이 높게 나타났는데, 비타민 C는 열에 불안정하여 가열 시 dehydroascorbic acid로 산화된 후 파괴되기 때문에(Bak SS 등 2007) 추출온도가 60℃인 WBC보다 추출온도가 낮은 EBC에서 비타민 C의 안정성이 더 높았다고 사료된다. Njoku PC 등(2011)의 연구에서 과일을 20∼80℃로 가열 시 온도가 증가할수록 비타민 C 함량이 감소한다고 보고하였고, 미숙과 건여주의 열수 및 에탄올 추출물 연구(Nam SW & Kim MR 2017)에서도 열수 추출물보다 추출온도가 낮은 에탄올 추출물의 비타민 C 함량이 높다고 보고하여 본 연구결과와 유사하였다.

HPLC를 이용한 WBC와 EBC의 페놀성 화합물 함량 분석 결과는 Table 3 및 Fig. 1과 같다. 분석에 이용한 표준물질인 rutin, myricetin, quercetin, caffeic acid, gallic acid, vanillic acid 중 WBC, EBC 모두 370 nm의 파장 영역에서 rutin과 myricetin 2가지 물질이 검출되었다. WBC 분석 시 rutin과 myricetin의 retension time은 각각 27.964 min, 29.453 min이었고, rutin과 myricetin 함량은 각각 53.30 mg/100 g, 9.76 mg/100 g이었다. 또한 EBC 분석 시 rutin과 myricetin의 retension time은 각각 27.973 min, 29.486 min이었고, rutin과 myricetin 함량은 각각 65.44 mg/100 g, 4.38 mg/100 g으로 분석되었다.

Fig. 1. 
HPLC chromatograms for phenolic compounds of black currant extracts.

(A): water extract of black currant, (B): ethanol extract of black currant.

Jeong IH 등(2017)의 연구에서 블랙커런트에 함유된 rutin은 2.75 mg/100 g이었으며, Kim YJ 등(2017)의 연구에서 복분자는 48.1 mg/100 g, 블루베리는 8.5 mg/100 g의 rutin을 함유하고 있다고 보고하여, 본 연구의 WBC와 EBC에 함유된 rutin의 함량이 이들 연구에서 보고된 것보다 좀 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 국내에서 재배된 베리류의 myricetin 함량을 분석한 Kim SJ 등(2019)에 따르면 블랙커런트 2.62 mg/100 g, 사스카툰베리 0.51 mg/100 g, 아로니아 0.53 mg/100 g, 블루베리 1.33 mg/100g의 myricetin 함량이 측정되었다고 보고하여 본 연구의 WBC와 EBC에 함유된 myricetin의 함량이 더 높게 나타났다. Rutin과 myricetin은 free radical 제거 능력이 뛰어나 강한 항산화 효과를 가지고 있다고 알려져 있어(Lee AS & Jang SJ 2010; Chua LS 2013) 블랙커런트의 항산화 활성에 기여하며, 특히 rutin은 항산화 활성뿐만 아니라, 열에 의해 쉽게 파괴되는 비타민 C를 안정시키면서 흡수 작용에 도움을 주기 때문에(Buszewski B 등 1993) WBC와 EBC에 함유된 비타민 C의 항산화 활성에 긍정적인 영향을 줄 것으로 생각된다.

한편, Jeong IH 등(2017)은 50% 메탄올을 용매로 하여 블랙커런트를 상온에서 24시간 추출한 후 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과, protocatechuic acid, vanillic acid, rutin, epicatechin gallate가 검출되었다고 보고하였고, Bonarska-Kujawa D 등(2014)은 블랙커런트를 이산화황과 증류수를 혼합한 용매로 추출한 후 페놀성 화합물 함량을 측정하였을 때 chlorogenic acid, p-coumaroylquinic acid, quercetin, myricetin이 검출되었다고 보고하였다. 또한 Orsavova J 등(2019)의 연구에서 4가지 품종의 블랙커런트의 페놀성 화합물 함량을 측정하였을 때 품종에 따라 검출된 페놀성 화합물 종류와 함량이 모두 다르다고 보고하였다. 따라서 본 연구와 여러 선행 연구를 비교해 볼 때 블랙커런트 품종 및 시료 전처리 방법 등에 따라 검출된 페놀성 화합물의 종류와 함량에 차이가 나타난 것으로 보인다.

WBC 및 EBC의 DPPH radical 소거율은 Fig. 2와 같다. WBC는 50∼500 μg/mL의 농도에서 41.86∼93.82%의 소거율을 나타내었고, EBC는 동일 농도에서 39.26∼92.48%의 소거율을 나타내었고, 추출물의 농도가 증가할수록 DPPH radical 소거율이 높아지는 것을 알 수 있었다. Jeon SH & Kim BK(2020)의 연구에서도 아로니아 추출물의 농도가 5∼100 μg/mL일 때 DPPH radical 소거율이 48.28∼96.31%로 추출물 농도 증가에 따라 radical 소거율이 증가하였다고 보고하여 본 연구에서 나타난 블랙커런트 추출물의 DPPH radical 소거율 증가 양상과 유사하였다.

Fig. 2. 
DPPH radical scavenging activities of black currant extracts.

WBC: water extract of black currant, EBC: ethanol extract of black currant, Vit C: L-ascorbic acid.

Means with different small letters (a∼d) are significantly different among the different concentrations in the same sample by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Means with different capital letters (A∼C) are significantly different among the different samples in the same concentration by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

DPPH radical 소거율로부터 구한 IC₅₀값은 WBC 112.70 μg/mL, EBC 104.27 μg/mL로 나타나 EBC가 WBC보다 높은 radical 소거율을 보였다. 또한 WBC와 EBC의 DPPH radical 소거율은 300 μg/mL의 농도부터 비타민 C와 유의적으로 차이가 없을 정도로 우수한 DPPH radical 소거율을 보였다. 아사이베리 추출물의 생리활성을 연구한 Jang JY & Ko KS (2015)에 따르면 아사이베리 추출물의 DPPH radical 소거율은 0.5∼5 mg/mL의 농도에서 열수 추출물이 17.07∼73.02%, 에탄올 추출물이 19.00∼82.49%로 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 항산화 활성을 나타낸다고 보고하여 WBC 보다 EBC가 높은 radical 소거율을 보인 본 연구결과와 일치하였다. 또한 Ryu JY 등(2017)의 연구에서 DPPH radical 소거율이 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 양의 상관관계를 가진다고 보고되었는데, 본 연구에서도 EBC에 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 함량이 더 많은 것으로 분석되어 WBC보다 DPPH radical 소거에 더 효과적이었을 것으로 생각되었다.

WBC와 EBC의 ABTS radical 소거율은 Fig. 3과 같다. WBC는 5∼25 μg/mL의 농도에서 16.86∼88.57%의 ABTS radical 소거율을 나타내었고, EBC는 동일 농도에서 20.09∼89.34%의 ABTS radical 소거율을 나타내었으며, 추출물의 농도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하였다. Hong SJ(2017)의 연구에서 블랙커런트 추출물의 ABTS radical 소거율은 1∼100 μg/mL의 농도에서 열수 추출물이 0.2∼27.8%, 에탄올 추출물이 0.2∼42.0%로 보고하여 본 연구의 WBC와 EBC의 ABTS radical 소거율이 좀 더 높게 나타났다.

Fig. 3. 
ABTS radical scavenging activities of black currant extracts.

WBC: water extract of black currant, EBC: ethanol extract of black currant, Vit C: L-ascorbic acid.

Means with different small letters (a∼e) are significantly different among the different concentrations in the same sample by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Means with different capital letters (A∼C) are significantly different among the different samples in the same concentration by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

또한 IC₅₀값은 WBC가 14.24 μg/mL, EBC가 13.10 μg/mL 으로 EBC가 WBC보다 높은 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 앞의 DPPH radical 소거율 결과와 일치하였다. 하니베리의 항산화 활성을 연구한 Lee YS 등(2016)에 따르면 ABTS radical 소거율은 에탄올 추출물이 54.9%, 열수 추출물이 17.5%로 측정되어 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 ABTS radical 소거율이 더 높았다고 보고하였다. 또한 Hong SJ(2017)의 연구에서도 블랙커런트의 ABTS radical 소거율은 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 항산화 활성을 가지고 있다고 보고하여 본 연구결과와 일치하였다. 앞에서 항산화 효과가 있다고 알려진 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 비타민 C 함량이 WBC보다 EBC에 더 많이 함유된 것으로 분석되었는데, 이러한 항산화 물질이 EBC의 항산화 활성을 높이는 데 기여했을 것으로 판단되었다.

FRAP 분석결과, 50∼300 μg/mL의 농도에서 WBC는 12.24∼72.10 FeSO₄ eqM, EBC는 18.41∼82.83 FeSO₄ eqM로 시료의 농도가 증가할수록 FRAP value가 높아져 항산화 활성이 증가하였다(Fig. 4). 블랙커런트 추출물(Jeong CH 등 2012)과 블랙커런트, 마키베리, 아로니아의 추출물(Chung HJ 2016)에 관한 연구에서도 추출 시료의 농도가 증가할수록 FRAP value가 상승하였다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 결과를 보였다.

Fig. 4. 
Ferric reducing antioxidant power value of black currant extracts.

WBC: water extract of black currant, EBC: ethanol extract of black currant.

Means with different small letters (a∼f) are significantly different among the different concentrations in the same sample by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Means are significantly different between WBC and EBC by student’s t-test (^***: p<0.001).

또한 EBC가 WBC보다 항산화 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었는데, 이는 DPPH radical 소거율과 ABTS radical 소거율 측정 결과와 마찬가지로 EBC가 강한 항산화 효과를 가지고 있는 폴리페놀, 플라보노이드, 비타민 C 등의 항산화 물질을 WBC보다 더 많이 함유하고 있기 때문으로 사료된다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 EBC가 WBC보다 항산화 활성이 높은 것으로 나타나 항산화 기능의 신소재로 활용되기에 더 적합한 것으로 판단되었다.