Journal Archive

본 연구에 사용한 자색고구마(신자미)는 농촌진흥청 바이오에너지작물센터에서 2011년에 재배하여 수확한 것이다. 자색고구마를 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea)하고, 40 mesh 분쇄기(FM909T, Hanil, Wonju, Korea)로 분쇄한 후 분말상태로 밀봉하여 냉동(-20℃) 보관하였다. 자색고구마 분말 50 g을 0.5% trifluoroacetic acid가 포함된 증류수 1.5 L에서 3시간 동안 상온에서 3회 반복하여 교반추출하였다. 이를 감압 여과한 후 hexane, ethylacetate, butanol로 각각 3회 반복하여 순차적으로 용매 분획을 실시하였다. 감압여과 후 용매를 제거하여 최종적으로 안토시아닌 분획물(anthocyanin rich fraction, ANF) 3 g을 얻었다. 시료는 냉동(-20℃) 보관하여 실험에 사용하였다. 본 연구진의 선행연구에서 자색고구마 신자미의 안토시아닌 함량은 1,342 mg/100 g dry weight이며, 구성은 peonidine 계열의 안토시아닌이 77.4%를 차지하며, cyanidine 계열의 안토시아닌이 22.6% 정도 포함되어 있다(Kim HW 등 2012).

4주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(Central Lab. Inc., Seoul, Korea)를 정상지방식이군(NF)과 고지방식이군(HF)으로 나누어 9주간 정상지방식이 또는 고지방식이를 공급하였다. 9주 후에 HF군을 두 군으로 나누어, 한 군을 HF군으로 나머지 군을 고지방식이 + ANF 50 mg/kg 투여군(ANF50)으로 하였고(Hwang YP 등 2011b), 8주간 더 사육하였다.

식이조성은 Table 1에 제시하였다. 정상지방식이(D12450J, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)는 지방 함량이 열량의10%를차지하였고, 고지방식이(D12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)는 지방 함량이 열량의 60%를 차지하였다. ANF는 주 5회씩 8주간 경구투여 하였으며, NF군과 HF군은 증류수를 동일하게 경구투여하였다(각 군당 n=8).

실험동물은 케이지당 2마리씩 임의 배치하여 사육하였다. 체중은 일주일에 1번씩 일정한 시간에 실험동물 저울을 이용하여 측정하였으며, 식이섭취량은 매일 일정한 시간에 공급하고 남은 양을 체크해 측정하였다. 모든 실험동물의 절차는 국립농업과학원 동물실험윤리위워회로부터 승인을 받아 수행하였다(승인번호 NAAS 1309).

17주 동안 사육한 실험동물은 15시간 절식시킨 후 탄산가스를 이용해 마취시키고, 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 30분간 실온에 방치 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 간은 채취하여 무게를 측정한 후에 액체질소로 급속 냉동하였으며, 조직학적 분석을 위해 간의 일부를 포르말린에 고정하였다. 지방조직은 개복했을 때, 복강 앞쪽으로 생식기관 주변에 저장되어 있는 지방(gonadal fat)과 뒤편으로 신장 주변에 저장되어 있는 지방(retroperitoneal fat)을 채취하였다. 간과 마찬가지로 지방 조직의 무게를 측정한 후에 액체 질소로 급속 냉동하였고, 조직학적 분석을 위해 gonadal fat의 일부를 포르말린에 고정하였다. 혈액과 조직은 분석 시까지 -80℃에 보관하였다.

공복 시 혈당 수준을 측정하여 초기 혈당으로 한 후 75% glucose 용액을 2 g/kg의 수준으로 경구투여하고, 30, 60, 120분에 꼬리로부터 채혈하여 혈당의 변화를 혈당측정기(Accu-Check Active, Roche, Germany)로 측정하였다. 각 시간별로 2번의 측정치에 대한 평균을 구하였다.

혈중 당 총콜레스테롤 농도는 효소법(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)으로, 인슐린은 ELISA kit(Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL)을 이용하여 측정하였다. 인슐린 저항성 지수(homeostasis model assessment-estimated insulin resistance, HOMA-IR)는 아래의 식에 의해 계산하였다(Jang HH 등 2012).

간 조직을 이용해 haematoxylin and eosin(H&E) 염색 슬라이드를 제작하고, 지방간의 정도를 판독하였다. 지방증은 간조직 전체에서 지방이 축적된 면적의 비율을 기준으로 점수화 하였으며, 판독기준은 Table 2에 제시하였다(Jang HH 등 2012).

지방 조직을 이용해 H&E 염색 슬라이드를 제작하고 지방세포 크기를 측정하였다. 현미경 ×400 배율 세 시야에서 제일 큰 지방세포 세 개의 장축의 길이를 구하여 평균을 구하였고, 군 평균을 도출하여 군 간 비교를 하였다.

실험결과는 평균±표준편차로 나타냈다. 처리간의 차이는 SPSS 프로그램 21.0(IBM Corp., Armonk, NY)에서 ANOVA를 실시한 후 군 간에 유의한 차이가 있을 때 사후검정으로 Duncan's multiple range tests에 의하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.

실험동물의 초기 체중, 고지방식이를 9주간 공급한 후의 체중, 최종 체중, 체중 증가량, 식이섭취량 및 식이효율은 Table 3에 제시하였다. 실험 초기 체중은 군 간에 유의적인 차이가 없었으며, 고지방식이를 9주간 공급한 후에 HF군과 ANF50군의 체중과 체중 증가량은 NF군에 비해 유의적으로 증가하였다. 식이섭취량은 HF군에서 NF군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났으며, 섭취량에 대한 체중증가량을 나타내는 식이효율은 ANF의 투여에 상관없이 HF군에서 유의하게 증가하였다. 간의 무게 또한 HF군에서 증가하였으나, ANF의 보충이 유의한 영향을 미치지 않았다.

본 연구에서 사용한 고지방식이는 soybean oil을 2.5%, lard를 24.5% 함유하여 지방으로부터 열량 공급이 총 열량의 60%를 차지하였다. 여러 연구에서 열량의 45% 이상을 지방으로 공급하는 고지방식이 급여 시 체중과 간 무게의 유의한 증가를보고한것은 본연구결과와 유사하다(Jang HH 등2012; Seo E 등 2010). 식이섭취량의 경우, 고지방식이에 의하여 의미있게 감소하였으나, 본 연구에서 사용된 고지방식이(5.24 kcal/g)는 정상지방식이(3.85 kcal/g)에 비해 열량이 높아 식이섭취량이 감소함에도 불구하고, 열량의 섭취를 증가시켰다. 식이섭취량에 따른 하루 총 열량 섭취량으로 보면, 정상지방식이 섭취군이 9.74 kcal/day, 고지방식이 섭취군이 12.45 kcal/day이다.

실험동물의 혈중 총 콜레스테롤 및 중성지질 함량을 Table 4에 나타내었다. 총 콜레스테롤의 경우, NF군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가하였고, ANF의 투여는 총 콜레스테롤 함량에 유의적인 영향을 나타내지 않았다. 중성지질의 경우, 고지방식이나 ANF의 보충에 의하여 군간에 유의한 차이를 보이지 않았다.

혈중 중성지질 함량의 증가는 일반적으로 고탄수화물 식이 섭취에 의해 관찰되어진다(Hellerstein MK 002). 또한, 본 연구 결과는 Eisinger K 등(2014)이 열량의 45%를 지방이 공급하는 고지방식이를 14주간 마우스에게 제공하였을 때 혈중 중성지질 수준이 정상지방식이 대조군과 차이가 없었다고 보고한 것과 일치한다. 즉, 50 mg/kg의 수준으로 공급된 자색고구마 유래 ANF는 고지방식이로 인한 체중이나 혈중 지질의 증가를 개선하는데 효과적이지 못한 것으로 나타났다.

실험동물의 혈당, 인슐린 및 인슐린 저항성 지수를 Table 4에 나타내었다. 혈당은 NF군에 비해 HF군에서 유의하게 증가하였으며, ANF의 투여가 고지방식이로 인한 혈당의 증가를 저해하지는 못하였다. 그러나 HF군에서 ANF의 첨가는 고지방식이로 인한 인슐린의 증가를 유의하게 저해하였다. 인슐린저항성 지수의 경우도, ANF50군에서 NF군의 수준으로 회복되었다.

Hwang YP 등(2011a)의 연구에 따르면, 지방으로부터의 열량이 총 열량의 45%를 차지하는 고지방식이를 공급한 마우스에게 자색고구마 신자미에서 유래한 안토시아닌 분획을 200 mg/kg의 수준으로 4주간 공급하였을 때, 혈당이 유의하게 감소하였다. 안토시아닌을 주요 성분으로 하는 자색고구마 색소체(purple sweet potato color)를 700 mg/kg 수준으로 고지방식이(60% 지방)와 함께 20주간 공급하였을 때도, 공복 혈당을 유의하게 감소시켰다(Zhang ZF 등 2013). 그러나 본 연구에서 ANF의 투여에 따라 혈당이 유의하게 감소하지 못한 것은 고지방식이의 지방 유래 에너지 함량, 공급 기간, 안토시아닌의 투여 농도 등의 차이 때문인 것으로 생각된다. 본 연구에서 사용된 고지방식이는 지방의 에너지 함량이 60%이고, 공급 기간도 17주로 더 길었으며, 이에 따라 고지방식이 대조군의 혈당이 Hwang YP 등(2011a)의 연구에서보다 더 높은 수준으로 나타났다. 또한 본 연구에서는 ANF가 50 mg/kg의 수준으로 공급되어 위의 두 개의 선행연구에 비해 각각 1/4, 1/12 정도로 낮은 수준이었다.

본 연구에서 ANF는 고지방식이로 인한 인슐린의 증가를 유의하게 저해시켰으며, 인슐린 저항성 지수도 개선시킬 수 있었다. Jang HH 등(2012)의 연구에서 안토시아닌이 2.5%를 차지하는 흑미 추출물을 식이 중 1%의 수준으로 7주간 공급하였을 때 고지방식이로 유의하게 증가한 HOMA-IR을 감소시키지 못하였다. 이것을 실험동물 개체 당 경구투여한 안토시아닌 함량으로 환산하면 29 mg/kg이며, 본 연구의 ANF 투여 농도 50 mg/kg의 약 절반 수준이다. 따라서 지방의 에너지 함량이 60%인 고지방식이를 공급한 마우스에서 50 mg/kg수준으로 ANF를 보충한 것은 혈당은 감소시키지 못하였으나, 고지방식이로 인한 고인슐린혈증을 저해시켰으며, 인슐린 저항성을 개선시키는데 효과적이라고 할 수 있다.

고지방식이와 ANF 공급에 따른 지방조직의 무게와 지방세포의 크기를 Table 5에 나타내었다. NF군에 비해 HF군의 gonadal fat, retroperitoneal fat의 무게가 유의적으로 증가하였고, ANF 투여에 의한 지방조직 무게의 유의적인 변화는 나타나지 않았다. 지방세포의 크기 또한 고지방식이에 의해 증가하였으나, ANF는 이러한 증가를 저해하지 못하였다.

Wu T 등(2013)은 mullberry에서 분리된 안토시아닌을 고지방식이를 섭취한 C57BL/6J 마우스에 40, 250 mg/kg의 수준으로 공급하였을 때 체지방이 농도의존적으로 유의하게 감소함을 보고하였다. 이 연구에서 사용된 mullberry의 주요 안토시아닌은 cyanidin-3-glucoside and cyanidin-3-rutinoside로 본 연구의 자색고구마의 주요 안토시아닌이 peonidin 3-caffeoyl-p-hydroxybenzoyl-sophoroside-5-glucoside과 cyanidin 3-caffeoyl-p-hydroxybenzoyl-sophoroside-5-glucoside인 것과 구별된다(Kim HW 등 2012). 식품에 함유된 개별 안토시아닌의 다양한 조성과 이에 따른 체지방 무게에 대한 영향, 관련된 분자 메커니즘 구명을 위한 추가 연구가 필요하다.

공복 시 혈당부터 시작하여 당을 경구 투여한 후 30, 60, 120분의 혈당을 Fig. 1에 나타내었다. 공복 혈당은 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았으나, 당 투여 후 30분에 NF군에 비해 HF군의 혈당이 유의하게 증가하였고, ANF의 투여는 혈당을 NF군의 수준으로 회복시키지는 못하였으나, HF군에 비해 감소시키는 경향을 나타내었다. 당 투여 60, 120분에서는 군 간에 유의적인 차이가 없었다.

Zhang ZF 등(2013)의 연구에서도 안토시아닌을 주요 성분으로 하는 자색고구마 색소체(purple sweet potato color)를 700 mg/kg 수준으로 고지방식이(60% 지방)와 함께 20주간 공급하였을 때, 내당능을 모든 시간별로 유의적으로 개선시켰다. ANF는 혈중 인슐린 농도와 HOMA-IR를 유의하게 감소시켰고, 결과적으로 포도당의 경구 투여 후 내당능을 개선시킨 것으로 사료된다.

Fig. 1. 
Effects of ANF on glucose tolerance in mice fed high fat diet.

Data are expressed as Mean±S.E. (n=8). Statistical significance was determined using ANOVA followed by a Ducan's multiple range tests (p<0.05). Abbreviations: NF, normal fat diet group (fat 10% of calories); HF, high fat diet group (fat 60% of calories); ANF50, high fat diet with anthocyanin fraction (50 mg/kg).

간 조직 내 지질의 축적 정도를 점수화 하여 Fig. 2에 제시하였다. NF군에서는 간 지질 축적 정도를 점수화 하였을 때, 0점(<5%)이 62.5%, 1점(5∼33%)이 37.5%인 것에 반해, HF군에서는 2점(34∼66%)이 크게 증가하였다. 그러나 ANF50군에서는 간의 지질 축적이 크게 억제되어 2점이 37.5%로 감소하였고, 0점과 1점이 3/5 이상을 차지하였다.

Song H 등(2016)은 sweet cherry 안토시아닌을 200 mg/kg수준으로 15주 동안 공급하였을 때, 고지방식이로 유도된 간조직 내 지질의 축적을 억제시켰다고 보고하였다. 또한, sweet cherry 안토시아닌은 간 조직의 DNA microarray 분석에서 PPARγ 경로 등 간의 지질 대사를 개선시키는 것으로 나타났다. Ling W 등(2016)은 안토시아닌(bilberries와 blackcurrants 유래)을 식이 kg 당 100 mg의 수준으로 16주 동안 공급하였을 때 고지방식이로 인한 미토콘드리아의 함량 감소, 미토콘드리아 biogenesis, 산화적 인산화 및 β-산화의 손상을 정상 수준으로 회복시켰다. 이것은 phosphorylated AMP-activated protein kinase(p-AMPK)와 peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α(PGC-1α)의 활성화에 의한 것으로 설명되었다. Hwang YP 등(2011a)의 연구에서도 안토시아닌의 간의 지질 축적을 저해 효과를 adenosine monophosphateactivated protein kinase(AMPK) 활성화를 통한 지방산 산화촉진에 의한 것으로 보고하였다. 따라서 본 연구에서 사용된 자색고구마 ANF는 간 조직 내 지방산의 산화를 촉진시킴으로 고지방식이로 인한 지방간의 유발을 억제시킨 것으로 사료된다.

Fig. 2. 
Effect of ANF on hepatic steatosis in mice fed high fat diet.

Photomicrographs of H&E stained liver from representative animals in the ND (a), HF (b), and ANF50 (c) groups(×400). Percentage of hepatic steatosis grade (0∼3 scale) within each groups (d). Data are expressed as percentage within group. Hepatic steatosis was graded as 0 (fatty hepatocytes occupying <5%), 1 (fatty hepatocytes occupying 5∼33%), 2 (fatty hepatocytes occupying 34∼ 66%), or 3 (fatty hepatocytes occupying >66%) Abbreviations: NF, normal fat diet group (fat 10% of calories); HF, high fat diet group (fat 60% of calories); ANF50, high fat diet with anthocyanin fraction (50 mg/kg).