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디클로로메탄(dichloromethane)은 J.T.Baker(Center Valley, PA, USA)의 HPLC급을 구입하였고, 에틸카바메이트, 부틸카바메이트, 수산화나트륨은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서, d₅-에틸카바메이트는 C/D/N Isotopes(Pointe-Claire, Quebec, Canada)에서 구입하였다. 염화나트륨은 SAMCHUN CHE-MICAL(Pyoungtaek, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였으며, 정제컬럼(Chem Elut, 50 mL)은 Agilent Technologies(Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였다. 각 가정에서 담근 매실주는 경기도, 경상도, 전라도, 충정도 지역에서 총 10개 시료가 수집되었다. 시중에서 판매되고 있는 상업용 매실주 5개는 마트에서 구입되었다.

에틸카바메이트 분석법의 정확성을 높이기 위해 2가지 내부표준물질(Table 1)을 사용하여 회수율을 비교하였다. 에틸카바메이트의 내부표준물질로 프로필카바메이트, 부틸카바메이트, d₅-에틸카바메이트가 사용되어 왔다(Kim et al 2010; Lim et al 2011; Huang et al 2013). AOAC 방법(AOAC 2000)에서 사용된 프로필카바메이트(propyl carbamate)는 생산이 중단되었기 때문에 제외되었다. 식품의약품안전청의 고시(KFDA 2008)에서 사용된 부틸카바메이트(butyl carbamate)와 에틸카바메이트의 에틸기 수소 5개가 중수소(deuterium)로 치환된 d₅-에틸카바메이트로 전처리하여 회수율을 비교하였다. 소주 시료에서 에틸카바메이트 18.93 ppb가 검출되었기 때문에, 회수율은 시료에 내재되어 있는 에틸카바메이트 함량을 제외한 양으로 계산되었다. 부틸카바메이트와 d₅-에틸카바메이트의 회수율은 77.47%와 101.00%이었다(Table 2). 이 결과는 부틸카바메이트의 탄소 수가 2개 더 많아, 극성, 끓는점 등의 화학적 특징이 에틸카바메이트와 차이가 있는 반면에, d₅-에틸카바메이트는 에틸기의 수소 5개만 중수소로 치환되어 에틸카바메이트와 물리화학적 성질이 유사하였기 때문으로 생각된다(Table 1). 따라서 d₅-에틸카바메이트가 에틸카바메이트 분석의 내부표준물질로 선정되었다.

시료의 전처리 과정에서 매실주를 중화시킨 이유는 알코올 음료의 산도를 중성으로 만들었을 때 반복실험의 표준편차가 크게 낮아지면서 재현성(reproducibility)이 향상되었기 때문이다(Lachenmeier et al 2006). 증류수를 첨가하여 알코올을 희석시킨 것은 알코올 농도가 20% 이상이면 에틸카바메이트의 회수율이 120% 이상으로 크게 높아진다고 보고되었기 때문이다(Xia et al 2014). 정제단계(clean-up)에서는 liquid-liquid extraction보다 solid-phase extraction(SPE)를 이용하는 것이 전처리 시간을 단축시키고, 간섭물질(interfering compounds)의 제거에 효율적이라고 보고되었다(Xia et al 2014). SPE 컬럼의 충전물이 primary-secondary amine 또는 florisil인 경우에는 유기산과 같은 저분자 화합물이 잔존한다는 제한이 있다. 따라서 본 연구에서는 유기산 함량이 높은 매실주의 특성을 고려하여 흡착제(sorbent)가 규조토(diatomite)인 Chem Elut으로 저분자 화합물을 제거하였다.

매실주의 주재료인 소주에 3가지 농도의 에틸카바메이트(50, 500, 3,000 ng)를 첨가하여 분석한 결과, 92.54∼103.59%의 회수율을 나타내었고, 상대표준편차는 0.87∼5.64%로 각 반복 횟수 간 편차가 크지 않음을 확인하였다(Table 3). CODEX에서 제시한 정량분석에 적합한 회수율 범위는 70∼120%, 상대표준편차 범위는 10∼20% 이내이어야 한다. 본 연구의 회수율과 상대표준편차는 CODEX의 분석기준에 부합되었기 때문에 에틸카바메이트 분석법으로 적합하였다. 분석법의 검출한계는 1.20 ppb이고, 정량한계는 3.65 ppb이었다.

8가지 농도의 에틸카바메이트와 d₅-에틸카바메이트의 농도비와 면적비를 통해 검량선을 작성한 결과, 상관계수(R²)의 값이 0.9992로 직선성(linearity)을 나타내었다. 이는 에틸카바메이트와 d₅-에틸카바메이트의 회수율과 반복성이 일정하여 농도의존적으로 농도비가 증가함에 따라 면적비 또한 일정하게 증가하였음을 보여준다. 에틸카바메이트와 d₅-에틸카바메이트의 질량스펙트럼을 비교한 결과, 분자이온(m/z 89과m/z 94), 메틸기가 제거된 토막이온(m/z 74와 m/z 76), 에틸기가 제거된 후 McLafferty 자리옮김 반응산물(m/z 62와 64)이 공통적으로 나타났다(Fig. 3). 그 중 m/z 62와 64가 주봉우리로 나타나 높은 감도(sensitivity)와 선별성(selectivity)을 고려하여 정량에 이용되었다. 선택이온 모드(SIM mode)에서 감도를 높이기 위해 6개 토막이온(m/z 62, 64, 74, 76, 89, 94)이 수집되었다. 내부표준물질인 d₅-에틸카바메이트와 분석물질인 에틸카바메이트는 각각 15.44분, 15.68분에서 검출되어 크로마토그램에서 완벽하게 분리되었다(Fig. 4).

Fig. 3. 
Mass spectra of d₅-ethyl carbamate (A) and ethyl carbamate (B).

Fig. 4. 
Total ion chromatograms of standard (A) and Maesilju sample (B) at m/z 62, 64, 74, 76, 89 and 94.

EC and d5-EC represent ethyl carbamate and d₅-ethyl carbamate, respectively.

에틸카바메이트가 모든 매실주 시료에서 검출되었고(Fig. 5), 시료 별 3회 반복의 상대표준편차는 20%를 넘지 않았다. 분석된 매실주의 에틸카바메이트 함량 범위는 최소 118.48 ppb부터 최대 2,640.42 ppb이었다. 이는 Kim et al(2013b)의 연구에서 보고된 대형 유통매장에서 구매한 매실주의 에틸카바메이트 평균함량인 79.18 ppb보다 높은 수치이다.

Fig. 5. 
Correlation between ethyl carbamate contents and aging years of Maesilju samples.

매실주, 와인 등의 알코올 음료를 제조할 때 갈변을 억제하기 위해 무수아황산을 첨가하는데, Hashiguchi et al(2010)은 매실주에 메타중아황산칼륨을 첨가했을 때 hydrogen cyanide가 cyanate로 산화되는 과정을 억제하여 에틸카바메이트 생성이 감소된다고 보고하였다. C1(197.99 ppb) 시료도 갈변, 착색 등을 억제하기 위해 무수아황산(anhydrous sulfur dioxide)이 첨가되었는데(Table 4), 이 화합물은 산화되는 과정을 억제함으로써 에틸카바메이트 전구체인 cyanate의 생성을 지연시킬 수 있다. 따라서 상업용 시료의 에틸카바메이트 함량과 원재료와의 연관성을 살펴보기 위해, 제품 용기에 표기된 원재료 및 함량을 Table 4에 제시하였다. 상업용 매실주 시료에서 가장 낮은 농도는 C1(197.99 ppb)시료였다. 이 시료는 매실 원액이 50%로 다른 시료의 매실 원액이 61∼100%인 것에 비해 상대적으로 낮았기 때문에, 매실원액에 존재하였던 에틸카바메이트가 더 희석된 것으로 생각된다. C3 (233.15 ppb) 시료에서는 C1 시료와 마찬가지로 무수아황산이 0.035% 이하 첨가되었으며, 매실주 원액은 62%로 약간 더 높았으나, 알코올 도수가 10%로 상업용 매실주 중에서 가장 낮아 에틸카바메이트의 생성이 낮았던 것으로 생각된다. 반면에, C4(1,076.82 ppb) 시료는 매실주 원액의 비율이 비교적 낮았지만 10년의 숙성기간 동안 cyanate와 알코올이 반응하여 가장 높은 농도의 에틸카바메이트가 관찰된 것으로 사료 된다. 다른 시료와 달리 제품에 매실이 담겨 판매되는 C2(461.05 ppb) 시료는 진열되어 판매되는 시간까지 cyanate와 알코올이 반응을 할 수 있기 때문에 에틸카바메이트의 농도가 높을 것으로 예상하였다. 실제로 C2 시료는 무수아황산과 알코올 함량이 같은 C1 시료(197.99 ppb)보다 에틸카바메이트가 2.3배 높게 검출되었다. 이러한 결과는 매실 원액의 함량, 첨가물, 침지기간이 에틸카바메이트 생성에 영향을 준다는 것을 보여준다.

집에서 담근 매실주의 에틸카바메이트 함량은 129.19∼2,546.67 ppb로 상업용 매실주의 함량(153.91∼1,193.36 ppb)보다 2배 이상 넓게 분포되었다. Kim et al(2013b)은 매실주를 제조하면서 숙성기간에 따른 에틸카바메이트 농도를 비교한 결과, 알코올 농도 및 매실과 소주의 담금비에 따라 제조 후 15∼90일까지 적게는 15.60 ppb부터 87.40 ppb까지 최대 5배까지 높아졌다고 보고하였다. 본 연구에서 매실이 술에 8년간 침지되었던 것으로 확인된 매실주의 에틸카바메이트 함량은 2,546.67 ppb로 가장 높았다. 반면에, 10년 동안 숙성된 시료의 에틸카바메이트 함량은 666.56 ppb로 오히려 낮았다. 이 시료는 10년 동안 숙성되었지만 일정 기간의 침지 이후에는 매실이 알코올에서 분리되어 저장되었기 때문에, cyanate의 용출이 낮았을 것으로 생각된다. 한편, 1년 동안 숙성시킨 시료 중 477.71 ppb이 검출된 시료는 10년 동안 숙성시킨 시료의 에틸카바메이트의 3/4에 해당되는 양으로 숙성시킨 시간에 비해 비교적 많은 양의 에틸카바메이트가 검출되었다. 일반적으로 3개월 후에 매실을 분리하는 것과 달리, 이 시료는 1년 동안 매실을 분리하지 않고 숙성된 시료였다. 전체적으로 매실주의 숙성 기간은 에틸카바메이트 함량과 양의 상관관계(R²=0.3328)를 나타냈다(Fig. 5). 에틸카바메이트 생성은 매실의 분리 시기 등 다양한 요인의 영향을 받기 때문에 본 실험에서는 숙성기간이 강한 요인으로 작용하지는 않은 것으로 생각된다.

Hwang et al(2009)은 16%와 30% 알코올 농도의 매실주를 45일에서 180일까지 저장기간이 길어질수록 에틸카바메이트 함량이 증가하였다고 보고하였다. 매실의 침출 기간이 길어질수록, 침출 온도가 높을수록 에틸카바메이트 함량도 증가되었다. 매실을 침출할 때 자외선의 양이 많으면 암실이나 냉장고에 보관한 것보다 에틸카바메이트 함량이 높아졌다. 90일 동안 설탕만으로 숙성한 매실엑기스에서는 에틸카바메이트가 검출되지 않은 반면에, 알코올과 숙성하였을 때는 60일부터 에틸카바메이트가 검출되었다(Kim et al 2013b). 매실 과육만으로 매실주를 제조하였을 때는 에틸카바메이트가 생성되지 않은 반면에, 매실씨로 제조된 경우에는 에틸카바메이트가 생성되었다(Hwang et al 2009). 이러한 연구결과를 종합해 보면, 본 연구에서 수집된 매실주는 각기 다른 방법으로 제조되었기 때문에 에틸카바메이트 농도 범위가 큰 것으로 사료된다.

지금까지 발효식품과 알코올 음료에서 에틸카바메이트 생성을 낮추기 위한 다양한 방법이 시도되어 왔다. 아르기닌을 분해하여 요소 또는 시트룰린을 생성하는 효소인 arginase의 gene을 포도주 발효 효모에서 제거하거나, acid urease를 처리하여 요소를 분해하거나, 증류방법을 개선하는 방법 등이 개발되어 적용되었다(Fujinawa et al 1992; Liu et al 1996; KFDA 2011). 미국 FDA와 캘리포니아양조협회는 포도주의 에틸카바메이트 함량을 낮추기 위해 ‘Ethyl Carbamate Preventative Action Manual’을 작성하여 포도주 제조업자들에게 보급하여 에틸카바메이트 생성을 저감화 할 것을 권고하고 있다(Butzke & Bisson 1997). 우리나라에서는 식품의약품안전청이 ‘주류 중 에틸카바메이트(EC) 저감화 매뉴얼’을 배포하여(KFDA 2011) 매실주를 제조할 때 에탄올 함량을 50% 이하로 낮추고, 매실의 침출기간이 길어질수록 매실 씨앗에 포함된 시안화물의 용출이 높아질 수 있으므로 매실의 침출기간을 100일 이내로 할 것을 권고하고 있다. 또한, 핵과류의 침출온도를 낮게 유지하고, 침출기간을 줄여야 하며, 침출액을 저장할 때 상온 이하의 햇빛이 들지 않는 장소에서 숙성시켜 에틸카바메이트 생성량을 최대한 낮출 것을 권고하고 있다.