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본 실험에 사용된 백년초 열매분말은 제주백년초(Jeju, Korea)에서 구매하였다. 환원력 측정에 필요한 potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic anhydrous는 Daejung Chemicals & Metal Co., Ltd.(Siheung, Korea)에서 구입하였고, 항산화 활성 측정에 사용한 Folin-Ciocalteu phenol reagent(FCP), Na₂CO₃, gallic acid, copper(Ⅱ) chloride, neocuproine, 2,2-phenyl-1-picryl-hydrazyl(DPPH)와 ascorbic acid와 세포 독성 측정에 사용한 thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)와 멜라닌 합성 유도를 위한 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 B16F10 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받았다. 세포 배양을 위해 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)은 WELGENE Inc.(Daegu, Korea)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL.(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Junsei Chemical Co., Ltd.(Chuo-ku, Tokyo)에서 구입하였다.

건조된 백년초 열매 분말에 10배수의 증류수를 가하여 잘 섞어준 뒤 autoclave에서 121℃에서 15 min 동안 열수 추출 후 Whatman No.1 여과지로 여과해 동결건조하여(LP30, IlshinBioBase, Dongducheon, Korea) —20℃에서 보관하면서 이후 분석에 사용하였다. 백년초 열매 물 추출물은 이후 WEC(water extract of cactus)로 명명하였다(Table 1).

총 폴리페놀 함량 실험은 Gutfinger T(1981)의 실험방법을 일부 변형 후 분석하여 진행하였다. WEC 200 μL, 에탄올 200 μL을 넣은 후 1,000 μL의 증류수를 가한 후, 각각의 혼합시료에 50%(v/v) FCP 100 μL을 가하여 5 min 동안 반응시켰다. 이후 200 μL 5%(w/v) Na₂CO₃를 추가로 가하고 1 hr 동안 암반응 시킨 후, 혼합시료를 vortexing 다음 최종 반응물은 200 μL씩 96-well plate에 분주하여 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA) 725 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 총 폴리페놀 함량은 에탄올에 용해한 gallic acid(GA)를 이용하여 표준 검량곡선 y=0.471χ—0.0465를 나타내어 이에 대입하여 환산 후 GA 당량(μg GAE/mL)으로 나타냈으며, 이때 표준 곡선의 R²값은 R²=0.9948의 결과값을 나타냈다.

DPPH 라디칼 소거능을 통해 WEC의 항산화 활성 평가를 측정하였으며, 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하여 비교하였다. 에탄올에 용해시킨 200 μM의 DPPH를 96-well plate 190 μL 분주 후 WEC를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL로 각각 희석하여 10 μL를 넣고 어두운 곳에서 30 min 동안 반응을 시킨 후, microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA)를 통해 517 nm의 흡광도를 측정하였다. 대조군은 WEC 대신 DMSO 10 μL를 첨가하였고, 아래의 방법과 같이 DPPH 라디칼 소거능을 계산하였다. 또한, 양성대조군 ascorbic acid를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 단계 희석하여 비교하였다.

Cu²⁺이온을 Cu¹⁺로 전환시키는 정도를 측정하여 WEC의 환원력을 측정하였다. WEC를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 희석하여 각각 40 μL씩 넣어 주었으며, 증류수에 녹인 CuCl₂ 100 μM의 용액 20 μL, neocuproine 0.625 mM의 용액 80 μL 및 potassium phosphate buffer(pH 7.4) 10 mM을 60 μL를 96-well plate에 분주한 후 1 hr 동안 25℃에서 반응시켰다. 이후 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA)를 통해 454 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 WEC 대신 DMSO 40 μL를 첨가하였고, 양성대조군 ascorbic acid를 사용하여 WEC와 같은 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도로 희석하여 비교하였다. 환원력의 결과값은 Cu¹⁺/neocuproine의 extinction coefficient(7.95 × 10³ M^—1cm^—1)를 통해 454 nm의 흡광도에서 계산된 Cu¹⁺이온의 농도로 나타내었다.

WEC에 의한 B16F10 세포에서의 생존율을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. WEC를 포함한 FBS-DMEM을 24 hr 동안 처리한 후 FBS-DMEM을 완전히 제거 후 MTT-media를 200 μg/ mL 첨가 후 1 hr 동안 처리하였다. MTT-media를 제거하고 각 well에 DMSO를 500 μL씩 넣어 생성된 formazan을 녹인 후, 100 μL씩 96-well plate에 분주한 후 570 nm의 흡광도를 microplate reader(VersaMax, Molecular Devices, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA)를 통해 측정하여 세포 생존율(%)을 계산하였다.

WEC의 멜라닌 생합성 억제 활성을 B16F10 세포를 이용하여 측정하였다. 1 mM IBMX를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후 WEC를 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도별로 72 hr 동안 처리하였다. 배지 제거 후 PBS로 세척 후, trypsin-EDTA 200 μL를 사용하여 세포를 융해시킨 후 1,008 ×g에서 20 min 동안 원심분리하여 얻은 pellet을 1N NaOH와 10% DMSO에 용해시킨 다음 100℃에서 10 min 동안 고정 후에 405 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 내의 백년초 추출물에 의한 멜라닌 축적 억제 정도를 현미경을 통해 관찰하였다(IBM Corp., Armonk, NY, USA).

모든 실험은 3회 반복하여 나타냈고, 본 실험의 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 표현하였다. 통계처리는 SPSS software(Ver. 18, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. 그룹 간의 유의성 평가는 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 통해 진행하였고, Duncan’s test 및 t-test 방법의 사후검증을 통하여 각 구간의 유의성 차이 95%(p<0.05) 및 99%(p<0.01)로 비교 분석하였다.

페놀은 페닐기가 수산기를 가지는 방향족 화합물을 의미하며, flavonoid, tannin 및 lignan 등의 화합물이 있다(Crespy V & Williamson G 2004). 이는 수소 원자를 라디칼에 제공함으로써 안정화하며 산소와 반응을 어렵게 하여 안정한 유리 라디칼을 형성시킨다(Ahn SI 등 2007). 또한, 식물의 총 폴리페놀 함량은 전자공여능과 밀접한 상관관계가 존재하여 총 폴리페놀 함량이 높아짐에 따라 전자공여능이 높아지며, 그 효능이 높게 나타나는 경향이 있다고 보고되었다(Kim HK 등 2002; Seog HM 등 2002). 본 실험에서는 백년초 열매 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 함량에 대해 gallic acid를 기준물질로 하여 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. WEC의 총 폴리페놀 함량을 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 실험하였을 때 1.74, 4.05, 6.77, 11.36 및 19.24 μg GAE/mL의 결과를 나타내었다. Kim JY 등(2021)은 70% 에탄올의 손바닥 선인장 줄기와 열매 추출물을 통해 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 줄기와 열매의 각각의 총 폴리페놀 함량은 8.00과 9.46 mg GAE/g의 결과를 나타냈다. 또한, WEC와 같이 천연물에서 얻어지는 폴리페놀은 다양한 생리 활성을 가지고 항산화 작용을 나타내며(Bravo L 1998), 항산화 활성에 대한 효과는 같은 종이라도 부위에 따라 나타내는 활성이 다름을 확인할 수 있었다. 또한, Yoon JA 등(2009)은 백년초와 같은 선인장과인 천년초 선인장의 각 부위별 메탄올 추출물을 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 그 결과 천년초 선인장의 열매 추출물의 경우 4.49 g/100 g 수준을 나타내었다. WEC는 같은 선인장과 추출물과 비교하였을 때 총 폴리페놀 함량이 높은 수준으로 나타났다. 이처럼 총 폴리페놀 함량이 높을수록 폴리페놀 내 다수의 수산기는 여러 화합물과 결합하여 우수한 항산화 효능을 나타낸다(Lu Y & Foo LY 2000). 따라서 WEC는 항산화 작용에 있어 높은 활성을 나타낼 것이라고 사료된다.

Fig. 1. 
Total phenolic content of WEC.

The total phenolic of WEC was analyzed at 10, 50, 100, 200 and 400 μg/mL in this test. Each value was displayed as mean±S.D. Values with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test at p<0.05. WEC: Water extract of a Opuntia ficus-indica var. saboten (cactus).

인체 내의 활성산소는 세포 내 세포막을 공격하여 인체의 노화와 질병을 유발하며, 이러한 자유라디칼에 의해 발생하는 노화와 질병을 억제하기 위해 전자공여능을 이용하여 항산화 활성을 측정한다(Lim SY 등 2007). 특히 천연물의 항산화능 측정은 전자공여능을 지표로 사용하며(Lee GD 등 1997), 본 실험에서는 DPPH 라디칼 소거능을 통해 전자공여능 측정을 진행하였으며 결과는 Fig. 2와 같다. DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 백년초 열매 추출물 WEC의 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 대조군과 비교하여 7.24%, 18.45%, 30.02%, 47.96% 및 73.98%로 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가함을 확인하였다. 양성대조군 ascorbic acid는 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 56.58%, 97.34%, 98.12%, 98.20% 및 98.21%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다. 항산화 능력이 뛰어나다고 알려진 양성대조군 ascorbic acid와 WEC를 비교하였을 때, WEC의 400 μg/mL의 농도와 ascorbic acid의 10 μg/mL의 농도에서 DPPH 라디칼 소거능 활성이 유사하게 나타났다. Kim DG 등(2018)은 손바닥 선인장과에 속하는 백년초와 천년초 열매의 75% 에탄올 추출물을 통한 DPPH 라디칼 소거능을 평가하였는데, 그 결과 250, 500 및 1,000 μg/mL 농도에서 백년초 추출물은 12.68%, 220.06% 및 c2의36.62%를 나타냈으며, 천년초 추출물은 10.12%, 13.01% 및 21.20%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. Park CM 등(2013)은 전남과 제주도 지역에서 자생하는 손바닥 선인장 줄기 80% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 활성을 비교하였으며, 100, 250 및 500 μg/ mL 농도에서 전남 손바닥 선인장 줄기 추출물은 6.17%, 16.37% 및 28.75%을 나타내었고, 제주도 손바닥 선인장 줄기 추출물은 9.67%, 26.46% 및 37.34%로 전남 선인장 줄기 추출물보다 제주도 선인장 줄기 추출물이 더 높은 DPPH 라디칼 활성을 나타내었다고 보고하였다. 따라서 WEC와 백년초 열매의 75% 에탄올 추출물을 비교하였을 때 추출 용매에 따른 차이가 있음을 확인하였고, 같은 선인장과인 천년초 열매의 75% 에탄올 추출물과 선인장 줄기 80% 에탄올 추출물을 비교하였을 때, WEC가 높은 수준의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냄으로 높은 항산화 효과를 가진다고 사료된다.

Fig. 2. 
DPPH radical scavenging activity of WEC.

The DPPH radical scavenging activities of WEC and ascorbic acid were analyzed at concentrations of 10, 50, 100, 200 and 400 μg/mL in this test. Each value was displayed as mean±S.D. Values with different letters mean significant differences between WEC and ascorbic acid by Duncan’s multiple range test at p<0.05. WEC: Water extract of a Opuntia ficus-indica var. saboten (cactus).

환원력이란 활성 산소종 및 유리기에 전자는 공여하는 능력으로서 항산화 활성의 기작이며, 이는 항산화 작용에 있어 중요한 요소이다(Siddhuraju P 등 2002). 본 실험에서는 Cu²⁺ 이온을 통한 WEC의 reduction power assay 결과를 나타내었으며(Fig. 3), WEC의 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 4.08, 17.52, 29.43, 41.25 및 42.11 μM 농도로 Cu²⁺ 이온을 Cu¹⁺ 이온으로 농도 의존적으로 환원하였다. 양성대조군 ascorbic acid 또한 같은 농도에서 각각 4.47, 19.38, 41.18, 40.57 및 41.63으로 Cu²⁺을 Cu¹⁺로 농도 의존적으로 환원시키는 경향을 보였다. WEC와 ascorbic acid를 동일한 농도에서 각각 비교하였을 때, 각 농도에서 환원시킨 Cu¹⁺이온의 유의적인 차이가 없었으며, 가장 높은 농도인 400 μg/mL 농도에서는 WEC가 양성대조군 ascorbic acid보다 높은 환원력을 나타냈으며, 이는 천연 항산화 물질과 WEC가 유의한 항산화 활성을 가지고 있음을 나타낸다. 백년초 열매 추출물의 환원력에 관한 기존 연구 결과는 매우 미미하였으며, Kim DJ 등(2011)은 백년초와 같은 손바닥 선인장과에 속하는 천년초의 열수 및 80% 에탄올 추출물에 대한 Fe²⁺ 이온의 환원력을 측정하여 결과값을 Optical density(OD) 700 nm의 값으로 나타내었다. 그 결과 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물이 각각 농도 1,000 μg/mL에서 0.157(OD700 nm), 0.069(OD700 nm)로 나타났다. 이와 같이 WEC은 Cu²⁺ 이온을 Cu¹⁺ 이온으로 변환하는 과정에 있어 높은 환원력 가지는 WEC은 천연 항산화 물질로서 중요하게 작용할 것이라 판단된다.

Fig. 3. 
The reduction power of WEC.

The reduction power of WEC and ascorbic acid were analyzed at concentrations of 10, 50, 100, 200 and 400 μg/mL in this experiment. Each value was displayed as mean±S.D. Each value is mean±S.D. Values with different letters are significantly difference between WEC and ascorbic acid by Duncan’s multiple range test at p<0.05. WEC: Water extract of a Opuntia ficus-indica var. saboten (cactus).

B16F10 세포에서 WEC에 대한 세포 독성을 확인하고자 MTT assay를 실시하였다. B16F10 세포가 70% 이상 찬 상태에서 10, 50, 100, 200, 400, 800 및 1,000 μg/mL의 농도로 WEC를 24 hr 동안 처리한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 104.20%, 108.01%, 111.33%, 100.44%, 93.16%, 87.67% 및 89.49%의 결과를 나타내었으며, 800 μg/mL에서 유의적인 세포 독성이 발견되었다(Fig. 4). 이후 실험에서는 유의적인 세포 독성을 나타낸 800 μg/mL 이상의 농도를 제외하고 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도를 통해 실험을 진행하였다.

Fig. 4. 
Effect of WEC on the viabilities of B16F10 cells.

The cell viability of WEC was analyzed at 10, 50, 100, 200, 400, 800 and 1,000 μg/mL in this experiment. Corresponding letters show significant differences by t-test (^* p<0.05). Control: IBMX 1 mM, WEC: Water extract of a Opuntia ficus-indica var. saboten (cactus).

B16F10 세포에서 WEC이 멜라닌 생합성을 억제하는지 알아보기 위해 B16F10 세포에 1 mM IBMX를 처리하여 멜라닌 생성을 유도하고, WEC를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도로 72 hr 동안 처리하였다. 그 결과 B16F10 세포 내 및 세포 외의 멜라닌을 측정하여 평가하였고, B16F10 세포에서 WEC를 처리하였을 때 세포 외로 분비되는 멜라닌 양을 관찰하였다(Fig. 5A). 또한, B16F10 세포 내에서 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 WEC는 각각 91.69%, 50.41%, 11.94% 및 13.90%로 농도 의존적으로 B16F10 세포에서 유의적인 멜라닌 형성 억제 효과를 나타내었으며(Fig. 5B), 이는 멜라닌 축적을 효과적으로 감소시킴을 알 수 있다. 멜라닌은 세포 내의 리보솜에서 tyrosinase 효소에 의해 여러 단계를 거쳐 합성하는 핵심 효소로 작용하며, 이 외에도 멜라닌 생합성 과정에서 주요한 인자로는 tyrosinase related protein-1(TRP-1), tyrosinase related protein-2(TRP-2) 및 microphthalmia-associated transcription factor(MITF) 등이 알려져 있다(Kwon OJ 2016). 백년초 열매 추출물의 멜라닌 억제에 관한 기존 연구 결과는 매우 미미한 실정이며, Ha MJ & You SH(2016)은 백년초와 같은 손바닥 선인장과인 천년초를 70% 에탄올로 추출하여 멜라닌 억제 실험을 진행하였다. 그 결과 3, 6, 12, 25 및 50 μg/mL 농도에서 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 25 μg/mL 농도에서 79.7%로 높은 감소율을 나타내었다. 본 실험에서 나타난 멜라닌 생합성 억제 효과에 대한 정확한 기전을 파악하기 위해서 멜라닌 생합성 억제에 영향을 미치는 주요 인자에 관한 추후 연구가 필요할 것으로 판단된다.

Fig. 5. 
Effect of WEC treatment on melanin accumulation of B16F10 cells.

(A) Accumulated melanin levels were analyzed by microscopic observation. (B) Melanin content of B16F10 cells. Each value is mean±S.D. Values with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test at ^* p<0.05 and ^** p<0.01. Control: IBMX 1 mM, WEC: Water extract of a Opuntia ficus-indica var. saboten (cactus).