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본 실험에 사용된 연자육은 광우약품(Changwon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 항산화 활성 측정에 필요한 2,2-phenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), ascorbic acid와 환원력 측정에 필요한 copper(Ⅱ) chloride, neocuproine과 총 폴리페놀 함량을 측정에 필요한 folin-ciocalteu phenol reagent, Na₂CO₃, gallic acid와 tyrosinase 저해 활성 측정에 필요한 sodium phosphate monobasic dehydrate, sodium phosphate dibasic, L-tyrosine, mushroom tyrosinase 그리고 arbutin은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한, 추출물을 희석하기 위해 사용한 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Junsei Chemica Co., Ltd.(Chuo-ku, Tokyo)에서 구입하였고, 실험 과정에서 사용한 에탄올과 환원력 측정에 사용되는 potassium phosphate monobasic과 potassium phosphate dibasic anhydrous는 Daejung Chemicals & metals Co., Ltd.(Siheung, Korea)에서 구입하였다.

연자육은 열풍건조기(HSED-1.5, Hansung Industrial Co., Ltd, Iksan, Korea)에서 60℃에서 수분함량이 20±1%에 도달할 때까지 건조를 실시하였다. 건조된 연자육 8 g에 70%(v/v) 에탄올을 넣고 85±2℃에서 3 hr 동안 추출기(MS-DM609, Misung, Seoul, Korea)를 이용하여 환류 추출한 후 53 μm 채 필터 및 Whatman No.1 여과지로 필터링하여 50℃에서 감압 농축(N-1001s-W, EYELA, Tokyo, Japan) 하였다. 그 후 —20℃에서 보관 후 실험에 사용하였다. 연자육 70%(v/v) 에탄올 추출물은 EL(ethanol extract of louts seeds)로 명명하였으며, 연자육 추출물의 수율(%, w/w)은 추출 전 연자육 시료 60.004 g에 대한 동결건조 후 연자육 건조시료 8 g을 백분율로 나타냈을 때 EL은 13.33%(w/w-dried louts seeds weight)의 추출 수율을 나타냈다(Table 1). Ahn SM 등(2018)은 분쇄한 연자육에 10배의 증류수를 가하고 열수 추출을 수행하였을 때 13.1%의 추출 수율을 보고하였다. 따라서, 연자육의 추출에 있어 물 및 에탄올 등 용매에 따른 추출 수율의 차이는 크지 않지 않은 것으로 사료된다.

EL의 총 폴리페놀 함량은 Gutfinger T(1981)의 방법을 일부 변형하여 분석하였다. Micro centrifuge tube에 EL을 농도 별로 각각 200 μL, 94.5%(v/v) 에탄올 200 μL, 증류수 1,000 μL를 넣고, 이 혼합용액에 50%(v/v) Folin-Ciocalteu phenol reagent(FCP) 100 μL를 첨가하여 상온에서 5 min 반응시킨다. 이후 5%(w/v) Na₂CO₃ 200 μL씩 가하고 1 hr 암반응 시킨 후 혼합용액을 vortexing 후 96-well plate에 200 μL씩 분주하여 microplate reader(Molecular Devices Tunabble Microplate Reader VersaMax, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid(GA)를 사용하여 나타낸 표준농도 곡선 y=0.0471χ—0.0465에 대입 후 환산하여 GA 당량(μg GAE/mL)으로 나타내었다.

EL의 항산화 활성을 평가하기 위하여 2,2-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성을 측정하고 양성대조군으로 ascorbic acid와 비교하였다. 94%(v/v) 에탄올에 용해한 200 μM의 DPPH 190 μL와 DMSO에 희석한 EL을 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL 농도(%, v/v)로 단계 희석하여 각각 10 μL를 넣고 30 min 동안 incubation 후 microplate reader(Molecular Devices Tunabble Microplate Reader VersaMax, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA) 사용하여 517 nm의 흡광도를 측정하였다. 대조군은 94%(v/v) 에탄올에 용해한 200 μM의 DPPH 190 μL에 DMSO 10 μL를 첨가하였고, DPPH 라디칼 소거능은 아래의 방법으로 계산하였다. 천연 항산화 물질로 잘 알려진 양성대조군 ascorbic acid 또한 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL 농도로 단계 희석하여 비교하였다.

EL의 환원력은 copper ion을 이용하여 측정하였다. 증류수에 녹인 100 μM의 CuCl₂ 용액 20 μL, 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.41) 60 μL, 0.625 mM의 neocuproine 용액 80 μL 그리고 EL을 각각의 농도에 맞게 40 μL를 96-well plate에 분주한 후 실온에서 1 hr 동안 반응시켰다. 이때 EL의 농도는 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL 농도로 단계 희석하여 사용하였다. 이후 반응이 끝난 후 microplate reader(Molecular Devices Tunabble Microplate Reader VersaMax, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 454 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 100 μM의 CuCl₂ 용액 20 μL, 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.41) 60 μL, 0.625 mM의 neocuproine 용액 80 μL 그리고 공시료액은 EL 대신 DMSO 40 μL를 첨가하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였으며 농도는 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL로 단계 희석해 사용하였다. 환원력 계산 방법은 copper(Ⅰ)/neocuproine의 extinction coefficient(7.95 × 10³ M^—1cm^—1)를 사용하여 454 nm의 흡광도에서 계산된 copper(Ⅰ)의 농도로서 결과값을 나타내었다.

EL의 미백 활성을 평가하기 위해 tyrosinase 저해 활성을 측정하였으며, 양성대조군으로는 tyrosinase 저해 활성이 우수한 미백 소재인 arbutin과 비교하였다. 96-well plate에 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.5) 220 μL, EL의 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL 농도로 단계 희석하여 20 μL를 분주하고, 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.5) 220 μL, 1.5 mM L-tyrosine 40 μL 그리고 EL을 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL 농도로 단계 희석하여 20 μL를 분주 후 tyrosinase(1,500 U) 20 μL를 첨가하였다. 이후 빛을 차단하여 15 min incubation 후 반응시켰다. 반응 후 microplate reader(Molecular Devices Tunabble Microplate Reader VersaMax, BaneBio, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.5) 220 μL, 1.5 mM L-tyrosine 40 μL, 공시료액은 DMSO 20 μL 그리고 mushroom tyrosinase(1,500 U) 20 μL을 넣고 반응시켰다. Tyrosinase 저해 활성에 대한 결과값은 아래의 방법으로 계산하였다.

실험에 나타난 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 표현하였으며, 통계처리는 SPSS software 18 ver.(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. 일원 배치 분산 분석(one-way ANOVA)을 통해 그룹 간의 유의성을 평가하였고, 사후검증은 Duncan’s test 방법을 통하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다(p<0.05).

식물의 잎, 과일, 뿌리, 열매 그리고 씨앗 등에 분포하고 있는 폴리페놀 화합물은 다양한 생리활성을 나타내고 있어 페놀화합물 물질과 항산화 활성 간의 작용 관계에 있어 많은 연구들이 진행되어왔다(Hwang CR 등 2011). 이러한 폴리페놀 화합물로는 flavonoids, catechins, anthocyanins, 그리고 resveratrols 등이 있으며(Dai J & Mumper RJ 2010), 용매에 따른 용해도가 다르며 구조적인 차이에 의해 과산화 지질 생성 억제와 같은 생화학적 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Middleton E & Kandaswami C 1994). EL의 총 폴리페놀 함량은 Fig. 1과 같다. EL을 100, 250, 500, 750 그리고 1,000 μg/mL의 농도로 하여 실험하였을 때 4.32, 9.92, 18.42, 25.02 그리고 29.67 μg GAE/mL의 함량을 나타내었다. 식물계의 폴리페놀 화합물은 식물의 고유한 색을 부여하며, phenolic hydroxyl기를 갖기에 단백질 등과 결합하는 성질을 가지며(Lee SO 등 2005), 이를 통해 고분자 화합물과 쉽게 결합하여 항산화, 항염증 그리고 항균 등 여러 생리활성을 나타낸 것으로 보고되어 있다(Kang MA 등 2010). 최근에는 폴리페놀 화합물이 가지는 다양한 건강 기능성을 확인하고, 새로운 기능성 식품의 소재로서의 활용 가능성과 효능에 대한 연구가 진행되고 있다(Lee SO 등 2005; Ryu MJ 등 2010). 이 연구에서 EL의 에탄올 추출물에 함유하는 폴리페놀 성분을 확인하였고, 이러한 성분은 라디칼 소거에 관여하여 항산화 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다.

Fig. 1. 
Total phenolic content of EL was analyzed.

The total phenolic of EL was evaluated at 100, 250, 500, 750 and 1,000 μg/mL in this experiment.Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).

항산화 활성을 측정하는 여러 가지 방법이 존재하나 DPPH 라디칼 소거 활성은 측정에 있어 방법이 간단하며 대량 측정과 비교적 짧은 시간 내에 항산화 활성을 측정할 수 있다는 이점을 가지고 있어 널리 사용되고 있다(Que F 등 2006). EL의 항산화 활성을 평가하고 비교하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성을 통해 실험을 진행하였으며 결과는 Fig. 2와 같다. 연자육 추출물 EL의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL 농도에서 대조군에 대비하여 4.28%, 9.56%, 11.02%, 24.77% 그리고 37.28%로 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다. 양성대조군인 ascorbic acid은 1, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL의 농도에서 7.82%, 33.15%, 43.59%, 61.05% 그리고 71.09%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈다. EL의 50 μg/mL의 농도와 ascorbic acid의 5 μg/mL의 농도에서 유사한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 라디칼 소거는 생체 내에서 발생하는 불안정한 유리기를 안정화하는 역할을 하며, 생체의 생리작용이나 산화작용을 통해 발생하는 수산화 라디칼 등을 제거함으로써 항산화 능력을 측정할 때 사용하는 지표로 사용되며, 높은 값을 나타낼수록 항산화 활성이 높다고 평가된다(Kim HK 등 2002; Canadanovic-Brunet JM 등 2005). Park SJ 등(2017)은 아가위 열매 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 50 μg/mL의 농도에서 19.26%의 DPPH 라디칼 소거능을 보고하였다. 따라서 EL은 다른 약용식물에 비교하였을 때 높은 수준의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냄으로 자유 라디칼에 대한 우수한 항산화 효과를 갖는다고 사료된다.

Fig. 2. 
Anti-oxidant activities of EL and ascorbic acid examined by DPPH radical scavenging activity.

The DPPH radical scavenging activities of EL and ascorbic acid were evaluated at concentrations of 1, 5, 10, 25 and 50 μg/mL in this experiment.Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).

본 실험에서 copper(Ⅱ) 이온을 통한 reduction potential assay 결과를 나타내었으며(Fig. 3), EL의 흡광도 수치는 시료의 환원력을 나타낸 것으로 높은 흡광도 수치를 나타낼수록 높은 환원력을 가짐을 알 수 있다. 환원력은 전자를 활성산소종 및 유리기에 공여하는 능력으로 항산화 활성에 있어 중요한 인자로 작용한다(Re R 등 1999). 1, 5, 10, 25, 50 μg/mL 농도의 EL은 0.79, 3.92, 8.11, 20.88 그리고 33.48 μM 농도로 copper(Ⅱ) 이온을 copper(Ⅰ) 이온으로 농도 의존적으로 환원하였다. 양성대조군 또한 농도 의존적으로 copper(Ⅱ) 이온을 copper(Ⅰ) 이온으로 환원시켰으며, 환원된 농도는 1.16, 5.10, 8.99, 22.99 그리고 43.22 μM 농도를 나타내었다. 같은 농도에서 EL과 ascorbic acid를 비교하였을 때, 각 농도에서 EL과 ascorbic acid가 copper(Ⅰ) 이온으로 환원시킨 농도가 유의적인 차이가 없었으며 이는 EL이 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid와 유의적인 항산화 활성을 가지고 있음을 의미한다. 연자육과 같이 폴리페놀 함량이 풍부한 천연 페놀성 물질은 유리 라디칼에 전자 원자를 공여하여 산화를 억제하여 인체 내의 노화를 방지하는 데 중요한 역할을 한다(Lee KD 등 1997). 따라서 EL의 주요한 항산화 활성은 copper(Ⅱ)을 copper(I)으로 변환시키는 결과에서 알 수 있듯이 환원력이 EL의 항산화 활성에 중요하게 작용할 것이라 생각된다.

Fig. 3. 
Copper (Ⅱ) reduction activities of EL and ascorbic acid, the copper (Ⅱ) reduction activities of EL and ascorbic acid were evaluated at concentrations of 1, 5, 10, 25 and 50 μg/mL in this experiment.

Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).

멜라닌 합성에 있어 tyrosinase 효소는 처음 두 단계에서 핵심적인 효소로 작용하며 tyrosinase를 효과적으로 억제하는 것은 미백 활성에 있어 중요한 기전 중 하나이다. 이 두 단계는 첫째, 수산화 된 L-tyrosine이 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)으로 전환되는 단계이며 두 번째는 DOPA를 도파퀴논으로 산화시키는 단계이다(Di Petrillo A 등 2016). Tyrosinase 저해에 높은 활성을 나타내는 유효물질로는 arbutin, kojic acid 그리고 ascorbic acid 등이 있지만 안정성 등의 문제로 최근에는 천연 물질에서 tyrosinase 작용을 억제하는 물질을 분리하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Jung SW 등 1995). 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL 농도에서 EL의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, 대조군 대비 각각 18.88%, 25.48%, 41.21%, 69.87% 그리고 89.65%의 저해 활성을 보였다. 양성대조군인 arubtin의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, EL과 동일한 농도에서 각각 —1.46%, 58.61%, 93.91%, 99.15% 그리고 99.37%의 tyrosinase 저해 활성을 나타냈다(Fig. 4). 각 농도별 EL과 arbutin의 tyrosinase 저해 활성을 비교하였을 때, 10 μg/mL의 농도를 제외하고 EL이 arbutin에 비해 낮은 활성을 나타내지만, 가장 높은 농도 400 μg/mL에서는 거의 유사한 tyrosinase 저해 활성을 나타냈다. 그러나 멜라닌 합성 과정에 있어 tyrosinase 뿐만 아니라 tyrosinase related protein-1(TRP-1) 그리고 tyrosinase related protein-2(TRP-2) 등과 같은 멜라닌 과정에서의 중요한 조절 인자의 단백질을 이용하여 멜라닌 합성 억제에 대한 연구가 이루어지고 있다(Parvez S 등 2006). 따라서 향후 연구에서는 tyrosinase 활성 억제뿐만 아니라 멜라닌 합성에 관여하는 중요 인자에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.

Fig. 4. 
Inhibitory activities of EL and arbutin on tyrosinase.

The whitening effects of EL and arbutin were evaluated at concentrations of 10, 50, 100, 200 and 400 μg/mL in this experiment.Different corresponding letters indicate significant differences by Duncan’s test (p<0.05).