Tyrosinase 하향조절을 통한 대두(Glycine max (L.) Merr) 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과

서 론

멜라닌(melanin)은 주로 사람의 피부, 머리카락 및 눈 등에 존재하고 있으며, 외부 환경으로부터 피부조직을 보호하는 역할을 한다(Lee EJ 등 2023). 이러한 멜라닌은 피부의 가장 바깥쪽인 표피의 기저층(basal layer)에 위치하고 있는 멜라닌 세포(melanocyte)에서 합성되며, 세포소기관인 멜라닌 소체(melanosome)에서 합성이 이루어진다(Circu ML & Aw TY 2010). 이 멜라닌 소체는 수상돌기를 통하여 인접한 각질형성세포(keratinocyte)에 멜라닌을 전달하고, 각질형성세포가 표피로 점차 이동하면서 멜라닌이 피부로 나타내게 된다(Dorsky RI 등 2000). 피부에서 적절한 멜라닌 함량은 자외선에 의한 피부 손상을 보호하며 더 나아가 피부암 발생의 위험을 낮추는 것으로 알려져 있지만(Videira IF 등 2013), 과잉 생산된 멜라닌이 피부에 축적될 경우에는 오히려 기미, 주근깨 및 피부 반점 등을 포함한 피부암 및 세포 사멸과 같은 질병을 유발할 수 있다(Yoon JW 등 2013).

멜라닌 형성과 관련하여 잘 알려져 있는 효소로는 tyrosinase, TRP-1(tyrosinase-related protein-1) 및 TRP-2 (tyrosinase-related protein-2) 등이 있으며 이 중에서도 특히 멜라닌 형성의 주효소인 tyrosinase는 멜라닌 생합성의 초기 반응에 관여하는 속도제한 효소로서 tyrosinase의 발현과 함량 및 활성에 의해 멜라닌 양이 결정되며, tyrosine을 기질로 하여 DOPA(3,4-dihydroxylphenylalanine)로 전환하는 tyrosine hydroxylase 활성과 DOPA를 DOPA-quinone으로 산화하는 DOPA oxidase 활성을 모두 가지고 있다(Kim KY & Lee NK 2014). 이에 따라 최근 의료 및 화장품 산업에서 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase 활성을 억제하는 것에 초점을 맞추고 있다(Pillaiyar T 등 2017; Pillaiyar T 등 2018).

현재까지 알려진 tyrosinase의 억제제로 사용할 수 있는 미백 물질은 ascorbic acid, kojic acid, azelaic acid 및 hydroquinone 등이 활발하게 사용되었지만, 이러한 합성 미백 소재는 대부분 알레르기 반응을 포함한 피부에 대한 안전성과 제품의 제형 안정성 등의 문제로 인하여 제한된 양만 사용하고 있으며(Imokawa G & Mishima Y 1982; Ando S 등 1993; Masuda M 등 1996), 미백 소재로 사용하기에 제한성을 가진다(Kim KY & Lee NK 2014). 또한, tyrosinase의 직접적인 소거 작용을 하는 기전만 알려져 있을 뿐 tyrosinase의 번역 단계, 발현 수준에서 저해 활성을 가지는 천연 소재에 관한 연구는 미약한 수준이다(Choung MG 등 2013). 따라서 알레르기와 같은 피부에 대한 예민 반응과 같은 한계점을 극복하기 위해 보다 부작용이 없으며, 효과적으로 tyrosinase를 조절하여 멜라닌 생성 억제 효과를 가지는 천연 소재에 관한 연구가 요구되고 있다.

대두(Glycine max (L.) Merr)는 필수아미노산의 함량이 높은 고단백 식품으로서, 우리나라를 비롯하여 동남아시아 국가 등에서 오랫동안 사용된 중요 식물 자원이다(Yoo KM 2011). 대두는 두부, 두유, 콩나물, 콩기름 및 콩가루 등으로 가공하거나 대두를 발효시켜 만든 된장, 청국장 및 간장 등으로 이용하고 있다(Xu B 등 2010; Chen KI 등 2012). 오랫동안 사용되어 온 만큼 대두의 항산화(Shukla S 등 2016), 항암(Sundaram MK 등 2018), 항고혈압(Vallabha VS & Tiku PK 2014) 및 항염(Yusof HM 등 2019) 활성 등 여러 생물학적 활성이 입증되었다. 이 밖에도 대두의 뿌리(Soares AR 등 2011) 및 파이토케미컬 성분인 글리세올린이 가지는 미백 활성에 관한 연구가 진행되었다(Lee YS 2010). 그러나 대두 추출물의 미백 등과 관련한 미용기능성 분야에 대한 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 대두 추출물의 미백 활성과 그 작용기전 규명을 통해 향후 천연 미백 소재로서의 적합성에 대해 조사하고자 하였다.

재료 및 방법

6. RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)에 의한 mRNA 발현 분석

GEE 처리가 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 유전자 수준에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 수행하였다. B16F10 세포에 GEE를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 처리하고 0.5 mM 농도의 IBMX를 120 hr 동안 처리하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 120 hr 동안 처리 후 Trizol^Ⓡ 시약을 600 μL에 처리·용해하여 획득한 용해물에 chloroform 100 μL를 첨가한 후 15 sec 동안 혼합시켰으며, 혼합물을 25℃에서 3 min 동안 정치시킨 후 4℃, 12,000 RCF, 15 min 조건에서 원심분리하였다. 원심분리 후 획득한 상등액은 isopropanol을 200 μL 첨가한 후 재현탁하여 25℃에서 10 min 동안 정치시켰다. 그 후 4℃, 12,000×g 조건으로 10 min 동안 원심분리하여 획득한 RNA 침전물을 75% ethanol 300 μL를 첨가하여 세척 후 4℃, 7,500×g, 5 min 조건에서 원심분리하였으며, 상등액은 제거하여 RNA 침전물을 건조시켜 RNase-free water를 첨가하여 용해시켰다. 분리된 RNA는 biodrop spectrophotometer (Biodrop, Cambridge, UK)를 이용하여 정량화하였고, CycleScript RT PreMix를 사용하여 48℃, 12 cycle 조건에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 thermal cycler(Bio-Rad, Berkeley, CA, USA)를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였으며, 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현 수준은 1.5% agarose gel을 사용해 전기영동을 실시하여 유전자 발현 수준을 분석하였다. 본 실험에서는 대조군으로 β-actin과 GAPDH가 사용되었으며, 멜라닌 생성에 관여하는 유전자 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 primer sequences는 Table 1에 나타내었다.

Table 1.

Primer sequences for RT-PCR analysis

결과 및 고찰

1. B16F10 세포에서의 GEE 처리에 의한 세포 생존율 평가

B16F10 세포에 GEE를 처리하였을 때 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT 분석을 통해 확인하였다(Fig. 1). MTT 분석은 세포 생존율을 측정하는 방법으로, 담황색 기질인 MTT가 살아있는 대사가 활발한 세포의 미토콘드리아 내의 redoxase의 효소 작용으로 인해 환원되어 보라색의 formazan을 생성하는데, 이를 용해액으로 용해시킨 후 살아있는 세포의 수를 측정하는 방법이다(Kim YE 등 2009). DMSO만 처리한 세포를 대조군으로 하여 100%로 보고 비교하였을 경우, GEE를 10, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/mL의 농도로 처리하였을 때, 99.12%, 104.52%, 103.82%, 106.60%, 95.91% 그리고 90.49%를 나타내었다. 따라서 추후 진행된 실험에서는 유의적 차이가 나타나지 않는 농도인 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도만을 선택하여 실험을 진행하였다.

Fig. 1.

Effect of GEE treatment on the viability of B16F10 cells.B16F10 cells were incubated with 10, 50, 100, 200, 400, and 800 μg/mL for 24 hr. Subsequent experiments were progressed within the concentration range that no significant difference in cell viability. Different corresponding letters indicate significant differences by Student’s t-test (* p<0.05).(+) Control: DMSO-treated for 24 hr in B16F10 cells.GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.

2. B16F10 세포에서의 GEE 처리에 의한 멜라닌 억제 활성 평가

GEE 처리가 B16F10 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해 0.5 mM IBMX로 멜라닌 생성을 유도하였으며, GEE를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 120 hr 동안 처리하여 멜라닌 억제 활성을 평가하였다(Fig. 2). 그 결과 GEE 처리가 B16F10 세포에서 총 멜라닌 함량을 46.69%, 44.42%, 27.90%, 19.37% 및 –3.15%로 농도 의존적으로 억제시키는 것을 확인하였으며(Fig. 2A), 총 멜라닌 함량 외에도 세포 외 및 세포 내에서도 동일하게 농도 의존적으로 억제함을 확인하였으며, 세포 외의 멜라닌 함량을 농도가 증가함에 따라 53.64%, 54.86%, 30.74%, 17.89 및 –8.85%로 억제하였고(Fig. 2B), 세포 내에서는 39.73%, 33.98%, 25.06%, 20.84% 및 2.28%로 억제하였다(Fig. 2C). 또한, 현미경과 이미지를 통해 GEE 처리에 의한 멜라닌 억제 정도를 확인하였다(Fig 2D, 2E). 따라서 B16F10 세포에서 멜라닌 생합성 억제율을 통해 GEE 처리가 세포 내 멜라닌 생합성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. Bodurlar Y & Caliskan M (2022)에 의하면 대두 세포 배양 추출물이 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 유의하게 억제한다고 보고하였으며, 이는 대두에서 발견되는 많은 이소플라본 및 기타 페놀 화합물의 효과적인 anti-tyrosinase 및 멜라닌 합성 억제 활성에 기인한 것으로 보고 있다. 이와 관련하여 이전 연구(Park JH & Kim GN 2023)에서 GEE의 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 이를 통해 GEE의 멜라닌 생성 억제 효과 또한 페놀 화합물과의 관계성이 있다고 판단할 수 있다.

Fig. 2.

Inhibitory effect of GEE treatment on the melanin synthesis of B16F10 cells.B16F10 cells were induced by 0.5 mM IBMX to incubate in the presence or absence of 10, 50, 100, 200, and 400 μg/mL for 120 hr. Melanin contents of B16F10 cells were quantified at 405 nm (A), (B), and (C). The secreted cellular melanin content was obtained using image scanner (D) and the levels of melanin content was analyzed by photomicrograph (E). Different corresponding letters indicate significant differences by Student’s t-test (* p<0.05, ** p<0.01 and, *** p<0.001).(-) Control: No treatment.(+) Control: 0.5 mM IBMX-treated for 120 hr in B16F10 cells.GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.

3. GEE 처리가 B16F10 세포의 멜라닌 생성에 관련된 유전자의 발현에 미치는 영향

멜라닌의 생성은 멜라닌 생성에 관련된 효소의 발현 및 멜라노좀을 통해 이동하는 과정에 의해서도 조절되며(Choe YS & Choe TB 2014), 멜라닌 생성 초기 반응에 작용하는 효소인 tyrosinase는 L-tyrosine을 L-DOPA로 hydroxylase하고, L-DOPA는 TRP-1 및 TRP-2 등의 효소가 관여하여 최종적으로 멜라닌이 합성된다(Yoon YM 등 2013). 또한, 세포 내에서 미백 효과는 tyrosinase의 발현 억제 및 tyrosinase의 활성을 감소시켜 멜라닌 생성에 미치는 영향을 파악함으로써 확인할 수 있다(Park SI 등 2021). 본 실험에서는 RT-PCR을 통하여 B16F10 세포에서 GEE 처리가 멜라닌 생성에 관여하는 대표적 유전자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 알아보고자 하였다(Fig. 3). GEE를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 120 hr 동안 처리하였을 때, GEE 처리는 TRP-1 및 TRP-2의 발현에는 아무런 영향을 미치지 않았지만(Fig. 3B), 멜라닌 생성 과정 중 핵심 요소인 tyrosinase의 발현은 유의미하게 하향 조절하였다(Fig. 3A). 이를 정량화한 결과 IBMX로 멜라닌을 유도한 (+) 대조군에 대비하여 GEE를 농도별로 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 tyrosinase의 발현이 감소함을 확인하였으며, 가장 높은 농도인 400 μg/mL의 농도에서는 (+) 대조군에 대비하여 2배 이상의 tyrosinase 발현을 감소시킴을 확인하였다(Fig. 3C). Shin SH & Lee YM(2013)에서 대두의 글리세올린은 B16F10 세포에서 멜라닌 세포 특이적 단백질인 tyrosinase 발현의 유의한 하향 조절을 통하여 미백 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다.

Fig. 3.

Effect of GEE treatment on the mRNA expression levels of melanogenesis-related genes in B16F10 cells.The total RNA of B16F10 cells were isolated by TrizolⓇ reagent. The mRNA expression levels of melanogenesis-related genes such as tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 were determined by RT-PCR (A) and (B). The mRNA expression levels of tyrosinase was quantified using Image J program (C). GAPDH and β-actin were used as a control. Different corresponding letters indicate significant differences by Student’s t-test (*** p<0.001 and ### p<0.001).(–) Control: No treatment.(+) Control: 0.5 mM IBMX-treated for 120 hr in B16F10 cells.GEE: Glycine max (L.) Merr ethanol extract.GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.TRP-1: Tyrosinase related protein-1.TRP-2: Tyrosinase related protein-2.

4. B16F10 세포 내에서 GEE 처리에 의한 Tyroinsae의 활성 감소

멜라닌 합성 과정의 주된 효소인 tyrosinase는 생체 내에서 tyrosine으로부터 DOPA와 DOPA quinone을 거쳐 최종적으로 멜라닌 고분자를 생합성할 때 관여하는 효소이므로 멜라닌 세포에서의 tyrosinase의 활성은 피부 멜라닌 생성에 결정적인 영향을 미치게 된다(Li W & Hill HZ 1997). 따라서 GEE 처리가 B16F10 세포 내에서 tyrosinase의 활성 자체에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 세포 내 tyrosinase의 활성을 측정하였다(Fig. 4). GEE를 10, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 120 hr 동안 처리하였을 때, tyrosinase의 활성은 IBMX만 단독으로 처리한 대조군 그룹과 비교하여 80.42%, 78.13%, 67.26%, 64.25% 및 40.46%로 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 대두의 isoflavone 성분인 글리시테인과 다이드제인의 대사 산물인 6,7,4′-trihydroxyisoflavone은 강력한 tyrosinase 활성 저해를 보이는 것으로 보고된 바 있으며(Chang TS 등 2005), 이 밖에도 대두의 다이진, 제니스테인 등은 anti-tyrosinase의 특성이 있는 것으로 보고되었다(Loizzo MR 등 2012). 이를 통해 GEE 처리는 tyrosinase의 유전자 발현 수준을 억제하는 것뿐만 아니라 세포 내에서 tyrosianse 활성 또한 억제하여 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

Fig. 4.

Inhibitory effect of GEE treatment on tyrosinase activity in B16F10 cells.Intracellular tyrosinase activity was determined with L-DOPA as the substrate. Different corresponding letters indicate significant differences by Student’s t-test (** p<0.01 and *** p<0.001).(–) Control : No treatment.(+) Control : 0.5 mM IBMX-treated for 120 hr in B16F10 cells.GEE : Glycine max (L.) Merr ethanol extract.

요 약

본 연구에서는 B16F10 세포에서 GEE 처리가 멜라닌 생성 억제 효과에 관한 기전을 규명하여 천연 미백 소재로서의 적합성을 검증하고자 하였다. 실험 결과 10, 50, 100, 200 그리고 400 μg/mL 농도로 GEE 처리하였을 때, B16F10 세포에서 농도 의존적으로 효과적인 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었으며, 멜라닌 생성에 관여하는 가장 주요한 tyrosinase만을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다. 대두 추출물은 tyrosinase의 유전자 발현량을 효과적으로 감소시켰으며, 이뿐만 아니라 세포 내에서 tyrosinase의 활성 또한 유의미하게 억제시키는 것을 확인하였다. 특히, 400 μg/mL 농도로 처리한 GEE에서 IBMX를 처리하여 멜라닌을 유도한 (+) control에 대비하여 우수한 멜라닌 축적 억제 활성을 나타냄을 확인하였으며, 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다. 따라서 GEE 처리에 의한 멜라닌 생성 억제 효과는 tyrosinase의 mRNA 발현 수준 감소와 활성 억제에 기인한 것이라고 판단되며, 이를 토대로 대두가 tyrosinase를 저해하는 향후 효과적인 천연 미백 소재로서 활용될 가능성이 높다고 생각된다.

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