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막걸리 제조에 사용된 효모는 ㈜충무발효(Ulsan, Korea)에서 생산하고 있는 건조분말 형태의 빵효모(La Parisienne, S.I. Leasaffre Co., Marcq-en-Baroeul, France; LP)를 사용하였다. 쌀은 오대미를 시중에서 구입하였고, 발효제는 역가 60 SP 이상의 ㈜조은곡식에서 제조된 쌀알누룩(JEGS Co., Ltd., Hwaseong, Korea), 1,800 SP의 개량누룩(Korea enzyme Co., Ltd., Hwaseong, Korea), 300 SP의 재래누룩(Songhak Co., Ltd., Gwangju, Korea)을 사용하였다[쌀알누룩: RN(Rice Nuruk), 개량누룩: MN(Modified Nuruk), 재래누룩: TN(Traditional Nuruk)].

막걸리는 쌀 10 kg을 세척시간을 합쳐 60분간 수침하고, 60분간 물빼기를 한 뒤 60분간 증자하였다. 제조된 고두밥에 발효제를 각각 30 SP/g의 비율로 첨가하였으며, 효모는 술덧량의 0.05%, 급수율 180%, 발효는 25℃에서 진행하였다. 발효기간은 전날과의 무게 차이가 0.5 g 이하로 될 때까지 하였고, 120 mesh를 사용하여 제성하고, 알코올 함량을 6.0%로 맞춘 후 0℃, 4℃, 15℃, 25℃에서 저장하여 사용하였다. 총산과 색도는 저장 45일까지, 유기산 함량은 저장 30일째 온도별로 측정하였다.

pH는 pH meter(Thermo scientific orion 3 star, USA)를 이용하여 측정하였고, 총산은 시료 10 mL를 0.1 N NaOH(96.0 %, Junsei, Tokyo, Japan) 용액으로 pH 8.2까지 적정한 다음, 소모된 0.1 N NaoH 용액의 양에 상당하는 시료 내 총산을 초산(acetic acid)으로 환산하였다. 아미노산도는 시료 10 mL에 0.1 N NaOH 용액으로 pH 8.2까지 적정한 다음, 중성 포르말린 용액 5 mL를 가하여 유리된 산을 0.1 N NaOH 용액으로 pH 9.2가 될 때까지 적정하고, 그 전후의 적정 mL 차이를 글리신(glycine)으로 환산하였다(National tax service 2009).

알코올 함량은 15℃에서 검정한 시료 100 mL에 증류수 50 mL를 혼합하여 증류하였다. 증류액을 80 mL 받고 증류수로 100 mL 정용한 후 15℃에서 주정계(Scale: 0∼10; 10∼20, Deakwang Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 휘발산 함량은 알코올 농도 측정에 사용한 증류액 30 mL를 취한 후, 0.01 N NaOH로 pH 8.2까지 적정하여 초산으로 환산하였다(National Tax Service 2009).

환원당은 DNS(Dinitrosalicylic acid) 법을 이용하여 분석하였다. 희석한 시료용액 1 mL에 DNS 시약 3 mL를 넣고 끓는 수욕 중에서 5분 동안 끓인 다음, 실온에서 냉각하였다. 증류수 21 mL를 넣고 잘 혼합한 후, 분광광도계(JP/U-200 Spectrophotometer, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 글루코스 표준 검량선을 이용하여 환원당 함량(%)을 계산하였다.

색도는 color meter(Ultra Scan PRO, Hunter Lab Inc., USA)를 사용하여 값을 측정하였다. Hunter 색차계인 L, a 및 b 값을 토대로 아래의 식을 이용하여 △E 값을 산출하였다(Joo & Choi 2012).

유기산 분석은 HPLC(LC-20A, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하였으며 post column 방법으로 분석하였다. 유기산 분석용 column인 TSKgel ODS-100V(4.6 mm × 250.0 mm)를 이용하여 분석하였다. 이동상은 0.1% phosphoric acid(Sigma Chemical Co., ST. Louis, MO, USA)이었고, 0.2 mM bromothymol blue(Sigma Chemical Co.)와 30 mM Na₂HPO₄(Sigma Chemical.)으로 반응시킨 후 UV 440 nm에서 검출하였다. Flow rate는 이동상 0.5 mL/min, 반응용액 1 mL/min이었고, column oven의 온도는 40℃로 하였다. 시료는 4℃에서 12,000 × g, 15분간 원심분리(CR 22G, Hitachi Koki Co., Tokyo, Japan)하여 상등액을 회수한 다음 여과지(0.2 μm, Millipore Co., Cork, Ireland)로 여과 후에 사용하였다.

모든 실험은 3회 반복으로 실시하였으며, 결과는 평균에 대한 표준편차로 나타내었다. 자료의 통계처리는 SPSS program(version 12)을 이용하였고, 실험구간의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.

쌀알, 개량, 재래누룩으로 만든 막걸리의 이화학적 특성은 Table 1과 같다.

쌀알누룩으로 만든 막걸리의 pH는 3.58로 개량, 재래누룩 4.26, 4.55에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며, 총산 함량은 0.93%로 반대의 결과를 보였다. 이는 탁·약주용 쌀알누룩은 주로 백국균으로 불리는 Aspergillus luchuensis를 사용하는데, 황국에 비하여 산 생성이 강한 것이 특징으로 주로 전분질의 당화, 향미 부여 및 술덧의 오염방지 역할을 해준다(Ha 1998). 알코올, 휘발산, 환원당 함량 및 아미노산도는 각각 17.5∼18.0%, 37.8∼90.47%, 1.23∼3.72%, 3.30∼6.67%로 발효제에 따라 차이를 보이지만, 전반적으로 시판 막걸리와 비슷한 수준의 막걸리가 제조되었음을 알 수 있다(Kang 2014). 막걸리를 제조하는 방법은 비슷하지만, 업체마다 고유의 방법을 채택하고 있기 때문에, 시판 막걸리가 아닌 별도의 공정과 첨가제 없이 만든 막걸리를 저장실험 시료로 선정하였고, 알코올 함량을 6.0%로 조정 후 진행하였다.

발효제별 막걸리의 저장온도 및 기간에 따른 총산 변화는 Fig. 1∼3에 나타내었다. 막걸리에서 총산은 풍미와 보존성에 영향을 주는 중요한 성분으로(Lee & Lee 2000) 누룩이나 원료에서 유래되거나 발효가 진행되면서 술덧 중의 효모, 젖산균 등의 미생물 작용으로 생성된 각종 유기산들에 의해 증가될 수 있다(Lee 등 1996). 재래누룩으로 만든 막걸리의 총산 함량이 저장온도 및 기간에 따라 가장 급격하게 변하였다. 초기 총산 함량은 0.26%이며, 0℃, 4℃에서는 저장 45일까지 비슷한 수준으로 유지된 반면, 15℃, 25℃에서는 저장 7일째 0.38∼41% 수준으로 증가하였고, 45일에는 0.52%까지 증가하였다. 개량누룩도 초기 총산 함량은 0.27%, 15℃, 25℃에서는 저장 7일째 0.37%로 증가하였지만 이후에는 비슷한 수준으로 유지되었다. 0℃, 4℃에서는 재래누룩과 마찬가지로 45일까지 초기 총산 함량을 유지하였다. 쌀알누룩은 초기 총산함량이 0.41%로 조금 높게 나타났으며, 저장기간이 증가할수록 총산 함량이 소폭 증가하였으나, 개량, 재래누룩에 비해서는 비교적 비슷한 수준으로 유지하였다. 식품의약품안전처 식품공전(Ministry of Food and Drug Safety)에는 탁주 규격에 총산은 0.5%(acetic acid) 이하로 명시되어 있기 때문에, 쌀알누룩으로 막걸리 제조 시 총산 함량은 0.5% 이하로 유지되면서 저장기간에 따라 증가하여 pH가 낮아지기 때문에 미생물 오염 측면에서 유리할 것으로 판단된다.

Fig. 1. 
Titratable acidity of Makgeolli with rice nuruk during storage at 0℃, 4℃, 15℃, and 25℃ for 45 days.

Fig. 2. 
Titratable acidity of Makgeolli with modified nuruk during storage at 0℃, 4℃, 15℃, and 25℃ for 45 days.

Fig. 3. 
Titratable acidity of Makgeolli with traditional nuruk during storage at 0℃, 4℃, 15℃, and 25℃ for 45 days.

발효제별 막걸리의 저장온도 및 기간에 따른 색도 변화는 Fig. 4∼6에 나타내었다. 막걸리에서 색의 차이는 원료 및 누룩 제조에 사용된 곡류, 첨가물에 따라서 다르게 나타나는 것으로 알려져 있다(Bae 2010). 본 실험에서는 처리구의 종합적인 색의 차이를 확인하기 위해 △E 값을 측정한 결과, 막걸리 저장 초기에는 발효제에 따라서 차이를 보였지만 비슷한 수준으로 확인되었다. 저장온도와 기간이 증가할수록 전반적으로 △E 값이 감소하여 초기의 막걸리 색과 차이가 발생함을 알 수 있었고, 발효제 중에서는 재래누룩이 상대적으로 감소하였다. 0℃, 4℃에서는 처리구 모두 초기 색도와 비슷한 수준으로 유지되었지만, 15℃, 25℃에서는 재래누룩이 쌀알, 개량누룩에 비해 각각 1.74∼3.19, 1.73∼2.50배의 색 차이가 발생하였다. 세부적으로는 색의 명도를 나타내는 L값이 저장온도 및 저장기간이 증가할수록 감소하였고, 쌀알누룩에 비해 개량, 재래누룩이 상대적으로 낮은 값을 나타내었다(data not shown). 막걸리를 저온에서 저장할수록 색의 변화를 최소화할 수 있으며, 쌀알누룩을 사용하면 개량, 재래누룩에 비해 L값이 높은 밝은 색의 막걸리를 제조할 수 있다.

Fig. 4. 
Color value (△E) of Makgeolli with rice nuruk during storage at 0℃, 4℃, 15℃, and 25℃ for 45 days.

Fig. 5. 
Color value (△E) of Makgeolli with modified nuruk during storage at 0℃, 4℃, 15℃, and 25℃ for 45 days.

Fig. 6. 
Color value (△E) of Makgeolli with traditional nuruk during storage at 0℃, 4℃, 15℃, and 25℃ for 45 days.

발효제별 막걸리의 저장온도 및 기간에 따른 유기산 함량 변화를 Table 2에 나타내었다. 쌀알, 개량, 재래누룩으로 만든 막걸리 모두 0℃, 4℃에서 저장 시 citric acid 함량이 69.7∼82.7%로 유기산의 대부분을 차지하였으며, 이는 시중 유통 막걸리의 유기산 조성을 분석한 Lee 등(2011)의 연구와 비슷한 결과를 보였다. 본 연구에서도 쌀알누룩 막걸리의 citric acid 함량이 82.5%로 개량, 재래누룩에 비해 높게 나타났다. 이는 쌀알누룩을 주로 백국균으로 불리는 Aspergillus luchensis를 사용하는데, 이는 황국에 비하여 산 생성이 강한 것이 특징이다(Ha 1998). 막걸리를 15℃, 25℃에서 저장할 때에는 citric acid 함량은 감소되거나 검출되지 않은 반면 lactic, acetic acid 함량이 크게 증가하였고, malic, succinic acid 함량도 소폭으로 증가하였다. 이는 생막걸리에서 효모 및 젖산균에 의한 발효가 미세하게 진행된 것에 기인한 것으로, malic acid가 lactic acid로 전환되는 MLF처럼 일부 citric acid가 소모되었을 것으로 판단된다. 재래누룩으로 만든 막걸리를 15℃, 25 ℃에서 저장할 때에는 citric, malic, succinic acid는 검출되지 않고, lactic acid 함량이 449.74∼637.11 mg/L까지 급격하게 증가하였다. 앞에서 저장온도 및 기간이 증가할수록 총산 함량이 증가하였는데, 이는 젖산균 증식에 의한 lactic acid 함량 증가로 판단되며, 따라서 막걸리의 저장성 및 품질 향상을 위한 열처리 기술, 막걸리에 적용 가능성이 높은 젖산균 억제 기술 개발이 필요할 것으로 보인다.