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본 실험에서 사용한 현미찹쌀은 2013년 10월산으로 경상북도 예천군에서 생산된 현미 찹쌀을 구매하였고, 배는 안성지역의 품종 신고배를 구매하여 사용하였다. 밀누룩은 ㈜진주곡자의(진주, 한국)에서 판매하는 앉은뱅이 밀을 주원료로 한 밀 누룩을 사용하였고, 쌀누룩(이화곡)은 화방누룩(강진, 한국)에서 판매하는 제품을 사용하였다. 종초로 사용한 것은 밀 누룩을 주원료로 한 초산정(경북, 한국)에서 판매하는 것과 쌀누룩을 주원료로 한 화방누룩의 종초를 각각 식초 총량의 10%로 사용하였다.

식초 제조방법은 누룩을 이용한 전통발효 방식으로, 수돗물을 이용하여 현미 쌀을 깨끗이 수세하고, 8시간 수침 후 1시간 물을 뺀 후 총 1시간 증자 (40분 가열 물주기, 10분 가열, 뜸들이기 10분) 하여, 고두밥을 한 후 냉각시켰다. 5 kg의 현미 고두밥을 담은 항아리 (㈜갈산토기, 충남 홍성)에 각각의 쌀누룩, 밀누룩, 쌀+밀 누룩을 고두밥 양의 10%를 넣고 버무린 후, 안성배 5 kg(2.5 kg 슬라이스, 2.5 kg 즙액)을 넣고 25℃에서 3일간 알코올발효를 진행하였다. 만들어진 알코올발효액에 각각의 종초 10%를 접종하여 발효유리병(Lock & Lock, 한국)에 넣어 28℃ 인큐베이터에서 진탕 방식으로 30일간 발효를 진행하였다.

총 산도는 30일간 발효시킨 각각의 현미배식초의 상등액 1 mL를 취하여 1%의 페놀프탈레인 지시약 2～3방울 떨어뜨린 후 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.2±0.1까지 중화시키는데 소요된 0.1N-NaOH의 소비 mL 수를 구하고 아래 식에서와 같이 초산(acetic acid)양으로 환산하여 총산도로 환산하였다.

총 질소량은 H₂SO₄(농황산)과 Kjeltab(분해촉매제)를 넣어 시료를 분해시킨 후 40% NaOH와 증류수(스팀)를 주입시켜 암모니아로 유리시켜 이를 혼합지시약이 들어있는 포집용액(Boric acid)으로 포집 후 0.1N HCl로 적정하고, Kjeltec auto sampler system 8400 analyzer(Foss Tecator, Hoganἅs, Sweden)를 사용하여 측정하였다.

시료 1 g에 80% ethanol 50 mL를 가하여 환류냉각기에서 75℃로 5시간 추출한 다음 3,000rpm에서 원심분리 시키고 상층액을 0.45 μm membrane filter(Woongki Science Co., Ltd., Seoul, Korea)로 여과한 다음 HPLC(Prominence HPLC, Shi- madzu Co., JAPAN)로 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87H ion exclusion column, column oven 온도는 40℃, mobile phase는 0.1N H₂SO₄, flow rate는 0.6 mL/min의 조건으로 사용하였다.

유리 아미노산의 분석은 시료 2 g에 에탄올 20 mL을 가한 후 homogenizer로 10분 동안 교반하여 1,900 × g에서 20분간 원심분리 하였고, 잔사에 다시 75% 에탄올 10 mL를 첨가하여 homogenizer로 10분 동안 교반한 후 1,900 ×g에서 20분간 원심분리 하였다. 상층액을 합하여 감압농축한 후 증류수로 용해시켜 sulfosalicylic acid 20 mg을 첨가하여 4℃로 1시간동안 방치시킨 다음 다시 1,900 ×g에서 20분간 원심분리한 후, membrane filter(0.2 µm)로 여과하여 아미노산 자동분석기(Biochrom 20, Pharmacia, England)로 정량분석 하였다. 이때 sodium citrate buffer (pH 2.2)를 buffer solution으로 사용하였고, buffer flow rate는 0.33 mL/min, ninhydrin flow rate는 0.33 mL/min, column temp.는 37℃, injection volume은 40 µL로 하였다.

총 페놀성 화합물 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색으로 발색되는 원리를 이용한 Folin-Denis 방법에 따라 분석하였다. 식초 시료(1 mg/mL) 0.2 mL에 10 % 2N-Folin-ciocalteu의 페놀 시액 0.4 mL를 혼합한 뒤 3분간 실온에서 반응시켰다. 10% Na₃CO₃(sodium carbonate) 0.8 mL를 첨가한 뒤 1시간 동안 암소에서 반응시킨 후, 750 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료에 함유된 총 폴리페놀 함량은 gallic acid (3.124∼400 ppm)의 표준곡선을 통하여 시료 g당 gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.

식초 시료(1 mg/mL) 0.1 mL에 증류수 0.5 mL와 5% NaNO₂ (sodium nitrate) 0.03 mL를 혼합한 뒤 6분간 실온에서 반응시켰다. 10% AlCl₃·6H₂O(aluminum chloride) 0.06 mL를 혼합한 뒤 6분간 실온에서 반응시켰다. 1 M NaOH 0.2 mL를 첨가 후, 증류수 0.11 mL를 넣은 뒤 415 nm에서 ELISA rea- der를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료에 함유된 총 폴라보노이드 함량은 catechin(3.12∼5,400 ppm)의 표준곡선을 통하여 시료 mg당 catechin equivalent(CE)로 나타내었다.

시료에 대한 전자공여능은 1,1,-diphenyl-2-picry1 hudrazy1 (DPPH)에 대한 환원력으로 Blois의 방법에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 0.05 mM DPPH 용액 0.768 mL와 0.192 mL 식초 시료를 4:1 비율로 혼합한 뒤 암소에서 30분간 반응시켰다. 96-well plate에 용액 0.2 mL를 첨가한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 DPPH radical에 대한 전자공여능은 아래 식에 측정된 흡광도 값을 대입하여 산출하였다.

식초 시료의 전자공여능을 ABTS assay로 측정하였다. 1.5 × 7 mM ABTS와 3 × 2.45 mM potassium persulfate를 2:1로 용해시켜 암소에 보관했다. 24시간 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.17±0.03이 될 때까지 EtOH를 용해시켜 ABTS radical cation 용액을 만들었으며, ABTS radical cation 용액 0.95 mL와 0.05 mL 시료를 혼합시킨 뒤 암소에서 10분간 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 ABTS라디칼에 대한 전자공여능은 아래 식에 측정된 흡광도 값을 대입하여 산출하였다.

본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS(Statistical Package for Social Science)를 이용하여 통계 분석하였다. 실험군당 평균 표준오차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 p˂0.05 수준에서 Tukey's test를 이용하여 상호 검정하였다.

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합(쌀+밀)누룩으로 제조한 현미배식초의 총산도를 분석한 결과는 각각 8.10, 7.50, 6.43 %으로 나타났다(Table 1). Moon SY 등(1997)의 식초의 종류별 미량성분과 관능적 특성비교 연구에서 산도는 3.65∼6.12 %이었고, 시판 현미식초의 산도는 5.1%로 보고되었다(Jeong YJ et al 1998). 본 실험에서는 이들 이전 연구들에 비해서 다소 높은 산도를 나타내었다. 양조식초의 신맛이 반드시 총산과 밀접한 관련이 있는 것은 아니며 산도가 높다고 해서 신맛이 강하다고는 할 수 없다(Kim HJ et al 1985; Moon SY et al 1997). 제품마다 신맛의 강약이 다른 것은 아세트산 함량뿐만 아니라 각종 유기산, 아미노산 염류 등 식초의 맛에 중요한 영향을 미치는 요인들이 많고 적음에 따라 신맛뿐만 아니라 전체적인 맛도 좌우되기 때문일 것이다.

국내 식초규격에는 총 질소 함량에 대한 내용이 없으나, 일본농림규격(JAS)의 경우 자국의 흑초 차별화 및 품질고급화를 위하여 총 질소 함량을 0.12% 이상으로 규정하였고, 총 질소 함량을 흑초 품질의 중요한 기준으로 삼고 있다. 총 질소 함량은 원료 사용량, 발효방법 등과 밀접한 관계가 있는 것으로 품질관리의 중요지표로 활용되고 있다. Joo KH 등(2009)의 연구에서는 현미식초의 발효방법 및 원료함량에 따른 품질변화에서 누룩을 이용한 전통발효 현미식초가 효모를 이용하여 제조한 현미식초보다 총 질소 함량이 4배 이상이 높은 값으로 나타났다. 이는 누룩에 포함 되어있는 다양한 효소들 중 현미원료의 단백질을 분해하는 효소가 있기 때문이다(Park JP et al 1993).

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합(쌀+밀)누룩으로 만든 현미식초의 총질소 함량은 각각 0.24, 0.23, 0.17%로 나타났다(Table 2). 일본의 흑초의 경우 koji를 배양하여 접종시키는 방법으로 식초를 제조하고 한국의 전통 발효 방식은 쌀과 밀로 만든 누룩으로 식초를 제조한다. 한국의 전통 식초의 주재료인 누룩 안에는 다양한 미생물들이 존재하여 이들의 발효 효소들이 현미원료의 단백질을 분해하는 능력이 뛰어나기 때문에 총 질소함량이 높다(Park JP et al 1993). 시판 현미식초의 총 질소 함량을 비교한 연구(Jeong YJ et al 1996)에서는 시판 현미식초의 총 질소 함량이 0.028%로 나타나 본 실험보다 낮은 함량을 보였다. 질소 함량의 결과를 보면 발효가 복합적으로 잘 일어나서 질 좋은 식초를 만들었다고 사료된다.

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초의 유리당을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 식초는 쌀, 보리 등의 곡류를 당화 하거나 과즙 등의 당류가 들어 있는 용액을 발효시켜 얻으므로 각종 당류가 함유되어 있으나, 식초 원료 중의 당분은 발효과정 중 초산균의 대사 작용으로 대부분 산으로 변화되고 일부는 에너지원으로 이용된다. 따라서 초산발효 후 식초 중의 당 함량은 미량이지만 식초의 감미와 산미의 조화에 관여한다. Yang YM (2009)에 의하면 전반적으로 대부분의 유리당 함량은 감식초가 가장 높았다. 자당은 감식초와 사과식초에서만 검출되었으며 맥아당 함량은 현미식초가 1,707.46 mg으로 가장 높았다. 젖산은 감식초에서만 검출 되었다. 리보오스는 현미식초가 232.42 mg으로 가장 높았으며 만노오스는 감식초와 사과식초에서 높은 함량을 나타냈고 갈락토오스의 함량은 감식초가 1,672.36 mg으로 가장 높았으며, 포도당은 시료 전반에 걸쳐 검출 되었으나 그중 특히 레몬 식초에서 함량이 924.15 mg으로 가장 높았다. 본 실험에서는 쌀누룩으로 만든 현미배식초에서는 포도당 성분이 2,110.90 mg/100g으로 가장 높게 나타났고, 밀누룩으로 만든 현미배식초에서는 갈락토오스가 919.09 mg/ 100g으로 가장 높았다. 혼합누룩으로 만든 현미식초에서는 대부분의 검출된 유리당 성분들의 함량이 쌀누룩과 밀누룩을 각각 사용하였을 때보다 낮게 분석되었는데 과당의 함량은 429.01 mg/100g 으로 다른 두 식초에서 보다 높았다. 전통발효 현미식초의 유리당 함량을 비교한 Lee SW(2012)의 연구에서는 과당과 자당 모두 검출되지 않았는데, 이는 현미만을 이용한 발효식초였기 때문이라 사료된다. 본 연구에서는 현미에 배를 첨가하여 만든 식초이기에 람노오스, 리보오스, 만노오스, 자일로오스의 다양한 당이 검출된 것으로 사료된다.

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초의 유기산을 분석한 결과는 Table 4와 같다. 쌀누룩을 사용한 현미배식초에서는 젖산과 초산 함량이 각각 3,778.74 mg/100g, 초산 3,159.39 mg/100g 으로, 주석산, 구연산, 사과산, 개미산, 옥살산보다 높게 검출되었다. 밀누룩을 사용한 현미배식초에서는 초산이 3,726.48 mg/100g, 젖산이 1,822.81 mg/100g으로 높았다. 혼합 누룩을 사용한 현미배식초에서도 초산 2,773.42 mg/100g, 젖산 2,248.35 mg/100g으로 다른 유기산들 보다 높게 검출되었다.

Moon SY 등(1997)의 연구에서도 국내 시판 현미식초의 주요 유기산은 초산, 구연산을 포함한 젖산, 옥살산, 호박산, 사과산, 주석산 총 7종이 검출되었다. 과일식초별 특정 유기산의 함량이 높은 것은 과일 자체의 유기산 구성에 영향을 받은 것으로(Lee DS et al 1972), 이전의 연구들에서 다양한 유기산 들이 과일식초에서 검출되었다(Kim CJ et al 1981; Jo BH 1987; Jeong YJ et al 1996; Jeong YJ et al 1999).

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초의 유리아미노산은 총 25종류가 검출되었으며, 그 함량을 분석한 결과는 Table 5와 같다. 세 가지 현미배식초에서 공통적으로 알라닌의 함량이 가장 높았으며, 그 다음이 글루타민산, 아르기닌의 순서로 분석되었다. 식초의 아미노산은 대체로 약 20여종의 유리아미노산이 검출되는 것으로 알려져 있고(Jeong YJ & Lee MH), Lee SW(2012)의 연구에서 현미식초의 유리아미노산 분석 결과는 글루타민산, 발린, 알라닌, 이소로이신, 로이신, 아르기닌 순으로 높은 함량을 나타내었다. Moon SY 등(1997)의 연구에서 현미식초는 글루타민산, 발린, 알라닌, 이소로이신, 로이신, 아르기닌 등의 함량이 높았다고 하였으며, 이는 본 실험 결과와 유사한 것이다. 유리아미노산 중 GABA(gamma-aminobutyric acid)는 비단 백태 아미노산으로 동물 중추신경계의 주된 억제성 신경 전달물질로 잘 알려져 있다. 본 실험에서 감마 아미노부티르산이 쌀누룩 현미배식초는 13.70 mg/100g, 밀누룩 현미배식초는 7.17 mg/100g, 혼합 누룩 현미배식초는 6.77 mg/100 g으로 나타났다. 총 유리아미노산의 함량을 보면 쌀누룩 현미배식초는 817.08 mg/100g, 밀누룩 현미배식초는 701.66 mg/ 100g, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초는 570.96 mg/100g으로 유의적인 차이를 보였다.

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초의 총 페놀성 화합물의 함량은 각각 8.3 mg GAE/mL, 6.7 mg GAE/mL, 5.7 mg GAE/mL로 분석되었고, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 각 현미배식초에서 총 페놀성 화합물의 함량은 유의적으로 차이가 있었다. Lee SW(2012)의 연구에서는 다양한 현미식초에서 총 페놀성 화합물 함량이 4.71∼11.60 mg/100 mL로 보고되었으며 이는 본 실험 결과와 유사하였다.

쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초의 총 플라보노이드 함량은 각각 0.40 mg CE/mL, 0.52 mg CE/mL, 0.21 mg CE/mL로 분석되었고, 그 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 총 페놀성 화합물 함량과 마찬가지로 각 현미배식초에서 총 플라보노이드의 함량은 유의적으로 차이가 있었다. 그러나 총 페놀성 화합물 함량은 쌀누룩으로 제조한 현미배식초에서 가장 높았는데, 총 플라보노이드 함량에 있어서는 밀누룩으로 제조한 현미배식초에서 가장 높았다. 이는 식초 원료의 차이에 의한 것이라 사료된다.

본 실험에서 쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩으로 제조한 현미배식초의 DPPH 소거능 분석 결과는 Table 6과 같다. 쌀누룩, 밀누룩, 혼합누룩의 DPPH 소거능에서는 각각 42.3%, 54.8%, 53.0% 로 차이를 보였다. Lee SW(2012) 의 연구에서 보고된 다양한 현미식초의 DPPH radical 소거능 91.27∼96.72%에 비하면 본 실험의 결과는 다소 낮게 측정되었다. 현미의 항산화 활성연구에서 DPPH radical 소거능은 도정도가 증가할수록 항산화활성이 감소되는 것으로 보고하였다(Ko MR et al 2011). Choi YM 등(2007)의 연구에서는 백미보다 현미에서 DPPH radical 소거능이 높은 것으로 나타났다. 이는 현미의 미강층에 존재하는 항산화 물질들과 연관이 있을 것이라고 보고하였다. 또한 Lee SM 등(2009)의 연구에서는 발효과정 중에 생긴 유기산 등의 추가적인 유효성분이 전자공여능의 측정값을 향상시킨다고 보고하였다.

Fig. 1. 
Total phenolics of brown rice pear vinegar.

Fig. 2. 
Total flavonoids of brown rice pear vinegar.

한편, 본 실험의 세 가지 현미배식초의 ABTS radical 소거능에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 쌀누룩 현미배식초 65.9%, 밀누룩 현미배식초 62.7%, 혼합누룩 현미배식초 64.7%로 측정되어 누룩 원료에 따른 차이는 없는 것으로 나타났다. Lee SW(2012) 의 연구에서 보고된 다양한 현미식초의 ABTS radical 소거능 84.83∼93.91% 에 비하면 본 실험의 결과는 낮게 측정되었다. 항산화활성은 폴리페놀, 플라보노이드의 항산화함량과 유사한 경향을 나타낸다고 하였고, 이와 같은 결과는 식초 내 함유된 폴리페놀 및 플라보노이드에 의한 것이라고 보고하였다(Lee SM et al 2009).