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본 실험에 사용한 대두는 경상북도산 백태(Glycine max)를 구입하여 에어제트밀(Retsch ZM100, ϕ=1.0 mm, Rheinische, Germany)로 초미세 분쇄하여 사용하였다. 분말화시킨 대두의 입도를 Lazer Particle Size Analyzer(Beckman Coulter Inc, Pasadena, California, USA)로 분석하여 평균 입도는 30.1 μm 크기로 액상 기질화 실험을 하였다. 초미세 분쇄 대두소재의 액상발효물에 적합한 홍국균주 개발은 한국생명공학연구원(Korea Research Insitute of Bioscience and Biotechnology 2015)에서 하였고, Monascus sp. RY1 균주를 이용하여 발효시킨 홍국발효 대두를 본 연구의 실험 재료로 제공받아 사용하였다. 일반 대두와 홍국대두 발효물을 —20℃에서 냉동시킨 후, 동결건조기(FD5512, Ilshin BioBase Co., Korea)로 건조하였다. 건조시킨 대두와 홍국발효대두는 각각 Ultra-Blender(Rumilly, Haute-Savoie, France)로 분말화하여 분말시료 1 g에 에탄올 10 g을 혼합 후 25℃에서 8시간 동안 3회씩 교반하여 추출하였다. 추출한 용액은 감압농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축시킨 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하여 본 실험의 시료로 사용하였다.

실험동물은 5주령의 C57BL/6J, SPF계 수컷 46마리를 ㈜대한바이오링크(Eumseong, Korea)에서 구입하여 온도 22±2℃, 상대습도 50.0±15.0%, 명암주기 12시간(명주기: 07:00∼19:00), 조도 150∼300 Lux, 환기 횟수 시간당 10∼20회로 자동 설정된 동물 사육실(Polysulfone, 331D × 159W × 132H(mm))에서 4주간 사육하였다. 실험 전 동물의 외관 검사를 실시하고, 체중 측정 후, 개체식별법에 따라 7일의 순화 기간을 거쳐 해당 동물실로 이동하며, 매일 1회 일반증상을 관찰하였다. 순화기간 종료일에 전자저울로 체중을 측정하고, 일반증상 및 체중 변화를 확인하여 체중증가에 이상이 없는 동물을 대상으로 체중을 기준으로 하여 동물을 배치하였다. 급여용 사료는 정상식이(10 kcal% fat: PO Box 19798, St. Louis, MO 63144, USA), 고지방식이(60 kcal% fat: PO Box 19798, St. Louis, MO 63144, USA)로 (주)두얼바이오텍에서 구매하여 사용하였으며, 급이기에 사료를 넣어 자유섭취시켰다. 시험물질은 투여 당일에 투여용량에 맞게 전자저울로 칭량한 후, 멸균수와 혼합하여 30분간 sonication 후 사용하였으며, 존데(DAZ01, Fuchigami, JPN)를 이용해 경구투여하였다. 실험군은 정상식이군(Nor), 고지방식이군(HF), 양성대조군(PC, Orlistat 30 mg/kg), 대두군(UPS)과 홍국발효대두 저농도(400 mg/kg, UPSM_L), 고농도(800 mg/kg, UPSM_H)로 총 6개 군을 나눠 28일 동안 사료를 하루 1회 동일한 시간에 경구투여하였다(Table 1). 사육 기간 중 식이 섭취량과 일반 증상 확인은 매일, 체중은 7일 주기로 일정한 시간에 측정하였다. 본 실험은 실험동물의 관리 및 사용에 적용하는 모든 규정을 준수하였고, 동물보호법(제정 1991년 5월 21일 법률 제 4379호, 일부개정 2020년 2월 11일 법률 제 16977호)에 근거한 ㈜KLSBIO 의 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의하여 승인을 받아 진행하였다(승인번호: KLSIACUC20201201-4-01).

동물실험은 4주간 조제한 식이를 급여한 후, 모든 생존동물에 대하여 심장채혈을 진행하였다. 시험 기간 종료 후, 모든 생존 동물에 대하여 주사기, 1 mL syringe(REF301321, BD, USA)로 심장 채혈은 살아있는 상태에서 호흡기마취기를 이용하여 이소푸루란 호흡마취제를 사용하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 4℃에서 3,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 얻은 혈청은 혈청 생화학적 분석에 사용하였다. 실험 최종일에는 12시간 절식 후 에테르로 가볍게 마취하여 해부를 하여 채혈 후 각 장기(간, 신장, 심장)를 적출하고, fat을 부위별(subcutaneous, mesentric, epididymal, peritoneal)로 적출하여 차가운 0.9% 생리식염수로 세척하고 여과지로 물기를 제거한 후 무게를 전자저울(BT224S, Sartorius, GER)로 측정한 후, 간 및 fat(epididymal fat) 조직의 일부는 조직검사를 위해 적출하여 시료로 사용하였다.

실험동물의 체중 변화를 확인하기 위해 전자저울(Entris 2202, Sartorius, GER)로 체중을 주 1회 일정한 시간에 측정하였고, 식이 효율(food efficiency ratio; FER)은 체중 증가량을 동일 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어서 산출하였다.

혈중 지질농도 및 생화학적 지표를 분석하기 위해 생화학자동분석기(H7020, HITACHI, JPN)를 이용하여 트리글리세라이드(Triglyceride: TG, mg/dL, WAKO, JPN), 총콜레스테롤(total cholesterol: T-Chol, mg/dL, WAKO, JPN), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL Cholesterol, mg/dL, WAKO, JPN), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL Cholesterol, mg/dL, WAKO, JPN), 종양괴사인자알파(TNF-α: pg/mL, Invirtogm, Waltham, Messachisetts, USA) 검사를 실시하였다. 또한, TNF alpha Mouse ELISA Kit(Invitrogen, Catalog # BMS607-3, Waltham, Messachisetts, USA)를 이용하여 항원항체 면역흡착법(ELISA)으로 TNF–α와 항체를 반응시킨 후 발색하여 ELISA 리더기(spectramaxM2, MOLECULAR DEVICES, USA)로 분석하였다(Kim H 등 2006; Ma Y 등 2017; Yeom CH & Jeong HJ 2020).

H&E 염색에 의한 간, 지방 조직 내 조직학적 변화 확인을 위해 간(좌측 큰엽)과 지방(부고환지방) 조직을 적출하고, 냉각 생리식염수로 세척하고 10% 포르말린에 고정시킨 후 장기를 조직표본 제작에 적합한 크기, 약 2∼3 μm의 두께로 삭정 후 개체번호가 작성된 카세트에 넣어 13시간 동안 조직처리(STP120 Spin tissue Processor, Myr)를 실시하였다. 이후, 박절기(Finesse ME Microtome, Thermo Shandon)를 이용하여 약 3 μm 두께로 절편을 슬라이드에 부착 건조 후 탈 파라핀과 함수 과정을 거쳐 증류수로 세척 후 H&E (hematoxylin and eosin) 염색을 하여 버추얼 슬라이드 스캐너(Pannoramic MID, 3D Histech Ltd., Budapest, Hungary)로 관찰하였다(Alwahaibi NY 등 2015; Cardel MI 등 2020).

간 조직 내 지질의 조직학적 변화 관찰을 위해 적출한 간조직은 액체질소로 급냉하고 Oil red O 염색에 의하여 분석하였다. 간은 적출하여 10% 포르말린에 고정시킨 후 조직표본 제작에 적합한 크기로 장기를 약 2∼3 μm의 두께로 삭정 후 30% sucrose(Merck) 용액에 처리하였다. Sucrose 처리가 완료된 조직은 OCT Compound(Tissue Tek OCT Compound)를 이용하여 cryoblock을 제작 후, 동결 박절기(CM3000, Leica)를 이용하여 절편을 제작하여 슬라이드에 부착하여 건조 후 Oil red O stain 염색을 실시하였다(Riva G등 2018).

실험결과는 평균치(mean)와 표준편차(Standard Deviation, S.D)를 사용하여 나타내었으며, 각 군간의 비교는 Software Statview(Version 4.51, Abacus Concepts, Berkeley, CA)를 사용하여 ANOVA분석 One-way analysis of variance를 수행하였으며, 유의수준은 p<0.05을 적용하여 검증하였다. 실험 그룹별 유의성은 SAS(Statistical analysis system) version 9.3(SAS Institute, Ctrlth carolina, USA)을 사용하여 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 군간의 유의성을 검증하였고, 유의성 표기가 a, b, c로 표기될 수 있게 사후검정을 수행하였다. 실험군간을 비교하여 5%의 유의수준에서 실험군간의 유의성을 검증하였다.

5주령의 동물을 4주간 정상식이와 고지방식이 유도 후 체중 변화 결과는 Table 2와 같다. 4주간의 체중 변화를 측정한 결과, 양성대조군을 제외한 전체 실험군에서 체중이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 정상식이군(Nor)의 체중은 3.0±0.3 g 증가하였고, 고지방식이군(HF)은 체중이 9.2±1.3 g 늘어나 가장 높은 체중 증가율을 보이면서 고지방식이에 의하여 체중증가 현상이 일어났으며, 양성대조군(PC)은 0.6±1.4g 증가로 가장 낮은 체중증가율을 보였다. 대두군(UPS), 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L) 및 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)은 고지방식이군(HF)에 비하여 유의적으로 낮은 체중증가율을 보였고(p<0.05), 특히, 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L)과 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)은 대두군에 비하여 유의적은 아니지만 낮은 체중 증가량을 보이면서 대두보다 홍국발효대두가 체중 감소 효과를 보이는 것을 알 수 있었다. 또한, 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L)과 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)의 경우, 정상식이군(Nor)과 가장 유사한 체중 변화를 보였다. Kim YW 등(2018)의 연구에서는 8주간 고지방식이 유도한 rat 실험 결과, 전체 실험군에서 약 304 g∼462 g 정도의 체중이 증가하였고, 홍국발효 참당귀 추출물 첨가 식이를 급여한 실험군에서 고지방식이군(HF)보다 약 79 g∼112 g 정도 상대적으로 낮은 체중 증가를 보여 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다.

실험군의 식이섭취량과 식이효율 결과는 Table 3과 같다. 전체군에서 식이섭취량 변화는 고지방식이군(HF)에서 높게 나타났고, 정상식이군(Nor)과 시료처리군에서는 유의적으로 큰 차이를 보이지 않았다. 이 결과는 Kim YW 등(2018)의 연구에서도 식이 섭취량과 음수 섭취량이 유의적인 차이를 보이지 않아 본 연구와 일치하였다. 식이효율은 시험물질 투여용량과 관련해서 떨어진 것으로 보이며, 시험물질들은 에너지대사를 촉진하는 것으로 사료된다(Table 3). 식이효율은 고지방식이군(HF)이 2.93±0.82로 가장 높았고, 양성대조군(PC)이 0.27±0.61로 가장 낮았다. 대두군(UPS)과 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L), 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)이 각각 2.01±0.61, 1.42±0.54, 1.45±0.33으로 고지방식이군(HF)보다 유의하게 낮음으로써(p<0.05) 대두 및 홍국발효대두가 식이효율에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과, 고지방식이로 비만 유도 후 대두에 의한 연구(Lee JJ 등 2011)에서도 고지방 처리군의 식이 효율이 가장 높게 나오고, 체중증가율이 낮은 대두군에서 낮은 식이효율을 보여 본 연구 결과와 유사하였다. 또한 Jang YJ 등 (2011)의 연구에서도 저지방식이군의 식이효율이 고지방식이군의 식이효율보다 낮게 나옴으로써 본 연구 결과와 일치하는 경향을 나타내었다. 이는 대두와 홍국발효대두 추출물을 첨가한 식이가 체중 감소에 도움을 주는 것으로 판단된다.

장기 무게 변화 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 정상식이군(Nor)에 비하여 고지방식이군(HF)은 전반적으로 장기의 무게가 증가하는 경향을 보였다. 대두(UPS), 홍국발효대두(UPSM) 실험군의 간과 신장의 무게와 심장비대증은 정상식이군(Nor)과 유의적인 차이가 없을 정도로 대두와 홍국발효대두의 효과가 있음을 보여주었다. 그러나, 간의 무게와 cardiac hypertrophy는 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L)과 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)에서 고지방식이군(HF)에 비하여 유의하게 감소함을 보였다(p<0.05). 특히 대두군(UPS)보다 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)의 신장의 무게, 간의 무게 및 cardiac hypertrophy는 통계적으로 유의하게 감소함으로써 홍국발효대두가 체중 및 장기무게 감소에 더 효과적인 것으로 사료된다. 또한, 신장 지방(peritoneal fat), 창자간막 지방(mesenteric fat), 부고환 지방(epididymal fat), 피하 지방(subcutaneous fat)무게는 전체 실험군에서 고지방식이군(HF)에서 정상식이군(Nor)에 비하여 유의하게 증가하였고(p<0.05), 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L)과 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)은 고지방식이군(HF)에 비하여 지방조직의 무게가 유의하게 감소함을 보였다(p<0.05)(Fig. 2). 홍국발효대두는 저농도보다 고농도군(UPSM_H)이 대두군(UPS)보다 신장지방, 창자간막지방, 부고환지방의 무게가 통계학적으로 유의하게 감소하는 것을 보였다(p<0.05). 이 결과는 대두보다 홍국발효대두가 장기 무게 및 지방무게 감소에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인함으로써 기능성 소재의 가치를 긍정적으로 보였다고 판단된다. Lee JJ 등(2011)의 연구에서 고지방-고콜레스테롤식이로 증가된 장간막지방조직과 부고환지방의 무게를 대두분말식이가 감소시킴을 보임으로써 본 연구와 비슷한 경향성을 보였다. 또한, 된장분말을 급여한 Lee HJ & Kim JG(2002)의 연구에서도 고지방-고콜레스테롤식이군의 간의 중량이 농도에 의존적으로 감소하였고, 부고환지방도 감소함을 보임으로써 본 연구 결과와 유사하였다. Hu J 등(2020)은 홍국에 있는 Monascin과 Ankaflavin은 HMG-CoAR의 단백질 발현을 감소시키고, 생체 내 콜레스테롤 합성을 억제하는 반면, apo A의 발현을 증가시켜 콜레스테롤 역수송을 촉진한다고 보고하였으며, 이는 혈중 지질, 체중 증가 개선에 영향을 미친다고 보고하였다. 본 연구에서 대두보다 홍국발효대두가 체중 감소에 더 효과적이었던 것은 홍국에는 풍부한 Monacolin 계열 성분이 존재하기 때문인 것으로 사료된다.

Fig. 1. 
Changes in organ weights in diet induced obesity model (DIO).

Groups are specified in Table 1. Each value represents the mean±S.D.

^a∼c Means indicated with different letters are significantly different among DIO groups at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Fig. 2. 
Changes in weight of fat tissue in diet induced obesity model (DIO).

Groups are specified in Table 1. Each value represents the mean±S.D.

^a∼e Means indicated with different letters are significantly different among DIO groups at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

혈중지질 농도 변화는 Fig. 3에 보여주듯이, 혈중 총콜레스테롤의 경우 고지방식이군(HF)에서 가장 높은 값을 보였으며, 홍국발효대두의 농도를 증가시킬수록 총 콜레스테롤이 감소함을 보였다. 또한, 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)의 경우 대두군, 고지방식이군(HF)과 비교하여 유의하게 낮은 LDL값을 보였다(p<0.05). 중성지방의 경우 대두군(UPS)과 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)은 고지방식이군에 비하여 유의하게 낮은 값을 보였다(p<0.05). 이는 Lee JJ 등(2011)의 연구에서 고지방-고콜레스테롤식이로 증가된 혈중 중성지방과 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 농도가 대두분말식이에 의하여 감소함을 보임으로써 본 연구와 비슷한 경향성을 보였다. Lim YR 등(2014)의 연구에서는 홍국균으로 고체발효한 에티오피아모카의 PPARɣ와 C/EBPα발현에 미치는 영향을 분석한 결과, 지방전구세포에서 PPARɣ와 C/EBPα발현을 억제하고 지방합성 및 수송에 관여하는 FAS와 aP2 발현량을 감소시킨다고 하였으며, 이는 홍국발효가 지방구 크기와 중성지방 생성량 감소에 영향을 미쳐 지방세포 분화 억제에 영향을 미친다고 보고하였다. 혈중의 지질 농도는 심장병, 고혈압 등과 같은 심혈관계 질환의 진단지표이다(Kim YW 등 2018). 비만의 경우, HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 균형이 깨져서 심혈관계 질환이 발병한다고 알려져 있다. Zhou W 등(2019)의 연구에서는 홍국균이 가지고 있는 Monascus 색소는 HMG-CoAR mRNA 발현을 억제해 콜레스테롤 감소에 영향을 미치며, Monascin과 Ankaflavin은 acyl-coenzyme A-cholesterol acyltransferase(ACAT)를 저해시켜 LDL 콜레스테롤을 감소시킨다고 보고하였다.

Fig. 3. 
Changes in blood biochemistry in diet induced obesity model (DIO).

Groups are specified in Table 1. Each value represents the mean±S.D.

TC: total cholesterol, TG: triglyceride, HDL: high density lipoprotein cholesterol, LDL: low density lipoprotein cholesterol.

^a∼d Means indicated with different letters are significantly different among DIO groups at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

TNF-α의 결과는 Fig. 4에 보여주듯이 고지방식이에 의해 유의하게 증가한 수치가 홍국발효대두 처리에 의해 유의적으로 감소하는 결과를 나타내었고(p<0.05), 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)이 대두군(UPS), 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L)보다 낮아 홍국발효대두 농도가 증가할수록 TNF-α의 발현 저해능이 높아지는 것으로 사료된다. Choi HW 등 (2018)은 홍국의 monacolin K가 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 TNF-α의 발현을 저해하고, 염증 반응을 증폭시키는 NF-κB를 차단하여 항염증 효과를 보인다고 보고하였다. 본 연구에서 홍국발효대두군에서 높은 TNF-α의 발현 저해능을 보인 것은 monacolin 계열 성분에 기인한 것으로 판단된다.

Fig. 4. 
Changes in blood TNF-α in diet induced obesity model (DIO).

TNF-α: tumor necrosis factor-α.

Groups are specified in Table 1. Each value represents the mean± S.D.

^a∼d Means indicated with different letters are significantly different among DIO groups at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

간과 지방 조직의 Oil Red O 염색 및 H&E stain 결과는 Fig. 5에 나타내었다. H&E stain 결과, 고지방식이군(HF)에서는 간 소엽 구조의 배열성이 깨지면서 지방들이 축적되면서 지방간 현상이 일어나면서 붉은색의 정도가 짙은 것을 관찰할 수 있었고, 홍국발효대두군에서 선홍색이 희미하게 관찰되면서 간 조직 내에 지질 침착을 억제하는 효과를 보였다. 이는 Ryu HJ 등(2011)의 연구에서도 고지방식이군(HF)의 간세포 내 지방 축적이 비정상적으로 나타났고, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서는 지방구 크기 및 수가 감소하여 지방 침착이 억제되었다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 또한 대두군(UPS)과 비교하였을 때 홍국발효대두에 의하여 지방 세포벽의 파괴가 적어짐에 따라 지방구의 크기가 감소하면서 지방 세포 내의 지방 축적을 방해하는 것으로 볼 수 있었다.

Fig. 5. 
Histological change of hepatic tissue.

(A) epididymal fat tissue (B) by H&E stained and hepatic tissue (C) using Oil red O stain for the male C57BL/6 mice (× 200). Groups are specified in Table 1.

Oil red 염색법은 지방이 많을수록 붉게 관찰되는 방법으로, 간 조직의 지방구를 붉은색으로 염색하여 확인하는 것이다(Kim YW 등 2018). Oil Red O stain 결과, 간조직에 축적된 지방구는 붉은색으로 염색되어 지방이 많을수록 붉게 관찰되어지는데, 고지방식이군(HF)은 붉은색이 광범위에게 퍼져 있었다. 홍국발효 대두를 고농도 투여한 군에서는 지방구에 의한 붉은 염색의 정도가 감소하면서 지방이 축적되는 현상을 억제함을 보여주었다. 전체 실험군에서 붉은색이 광범위하고 분포된 것을 확인할 수 있었으며, 가장 붉은색을 띄는 것은 고지방식이군(HF)으로 홍국발효대두 처리군에서는 상대적으로 덜 붉은 것으로 확인되었다. 홍국발효 참당귀 추출물을 급여한 Kim YW 등(2018)의 연구에서도 홍국발효 참당귀를 투여한 군에서 붉은색의 정도가 감소함을 보여줌에 따라 본 연구와 유사한 결과를 보였다, 본 연구에서는 대두군(UPS)보다 홍국발효대두 저농도군(UPSM_L)보다 홍국발효대두 고농도군(UPSM_H)이 덜 붉은 것으로 확인되어 대두보다 홍국발효대두가 간 조직의 지방 축적 억제에 효과가 있을 것으로 판단된다.