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Journal of the East Asian Society of Dietary Life - Vol. 32 , No. 3

[ Article ]
Journal of the East Asian Society of Dietary Life - Vol. 32, No. 3, pp. 190-201
Abbreviation: J East Asian Soc Diet Life
ISSN: 1225-6781 (Print) 2288-8802 (Online)
Print publication date 30 Jun 2022
Received 03 May 2022 Revised 06 Jun 2022 Accepted 22 Jun 2022
DOI: https://doi.org/10.17495/easdl.2022.6.32.3.190

김칫속 유래 유산균의 Probiotic 특성 및 이를 이용한 요구르트 발효
박윤성1 ; 임영순2,
1상지대학교 동물생명자원학과 석사과정
2상지대학교 동물생명공학과 조교수

Probiotic Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Seasoning and Its Application for Yogurt Fermentation
Yun-Seong Park1 ; Young-Soon Lim2,
1Master Student, Dept. of Animal Biotech Science, Sangji University, Wonju 26339, Republic of Korea
2Assistant Professor, Dept. of Animal Biotechnology, Sangji University, Wonju 26339, Republic of Korea
Correspondence to : Young-Soon Lim, Tel: +82-33-730-0542, Fax: +82-33-730-0503, E-mail: young229@sangji.ac.kr

Funding Information ▼

Abstract

This study was carried out to isolate lactic acid bacteria(LAB) from kimchi seasoning and identify a suitable probiotic strain for application as a commercial starter culture in yogurt. Three isolates from MRS agar and BCP agar plates were selected and designated as AH01, SS03, and LM07. The isolates were identified using the API 50 CHL kit and by 16S rRNA gene sequencing; AH01, SS03, and LM07 were identified as Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis subsp. lactis, and Leuconostoc mesenteroides, respectively. The characteristics determined to estimate their applicability in dairy products included acid and bile tolerance and caseinolytic properties. AH01(L. plantarum) was finally selected based on the biochemical characteristics of lactose usability and caseinolytic properties. AH01 was determined to be a mesophilic organism, and showed the highest resistance in both acids and bile salts. Additionally, AH01 exhibited an antibacterial activity clear zone of 11 to 13 mm, which was greater than the 9 mm zone of commercial L. acidophilus CSLA on 2 pathogens(S. Typhimurium and E. coli). Yogurt preparation using AH01 as a single starter culture, showed viable cell counts of > 5.0 × 108 CFU/mL. Moreover, the viscosity and syneresis were similar to the commercial L. acidophilus CSLA. During storage at 5℃, the counts of AH01 strain remained stable over 20 days. Our results indicate that lactic acid bacteria isolated from kimchi seasoning can be used in yogurt manufacturing as a starter culture.


Keywords: lactic acid bacteria, kimchi seasoning, L. plantarum AH01, yogurt

서 론

건강에 대한 관심과 질병예방식품에 대한 소비자의 needs는 그동안 지속적인 증가를 보여 왔으며(Arena MP 등 2015), 최근 들어서는 세계적인 pandemic 영향 등으로 건강기능성이 우수한 식품 신제품의 개발 필요성 또한 크게 높아지면서 기능성이 우수한 probiotics 유산균에 대한 연구가 주목받고 있다. 건강기능식품시장 분석결과(MFDS 2020)에 따르면 국내 건강기능식품 시장에서 probiotics 유산균은 전체 매출 비중 중 11.2%를 차지하며 홍삼에 이어서 2위의 기능성 원료로 선호되고 있다. Probiotics 유산균은 체내에 들어가서 정장효과를 포함하는 유익한 기능성을 가지는 살아 있는 균을 말하는 것으로, 섭취 후 장까지 살아서 도달하기 위해서는 내산성과 내담즙성이 요구된다. 또한, 산성의 유익균 증식 여건을 조성하여 정상 장내균총의 균형을 유지하고 배변활동 원활에 도움을 주는 기능성이 있다(Ouwehand AC 등 2002). 유산균은 탄수화물을 이용하여 젖산 등 유기산을 생성하는 미생물로서 전통적으로 우유, 육가공품, 채소 및 곡류 등 다양한 식품 원료와 함께 산업적으로 이용되어 왔으며, 발효공정을 통해 탄수화물과 단백질 및 지방성분 등을 분해하여 풍미를 증진시키고 영양학적 가치를 높여준다(Leroy F & De Vuyst L 2004; Prado FC 등 2008). 유산균을 이용하는 발효식품들은 probiotics로 인한 건강상의 이점 때문에 시장에서 점점 더 우수한 평가와 관심을 받고 있으며(Gerez CL 등 2012), 발효유와 숙성김치류 등이 포함된다. 발효유는 원유 또는 환원유 등을 유산균으로 발효하여 산미와 감미를 강화시킨 유가공 제품으로서, 우유의 일반성분 외에 유산균 생균체와 함께 lactic acid, peptone, peptides, oligosaccharides 등이 생성되어 영양학적으로도 우수하며 이에 대한 소비는 꾸준히 증가하고 있다(Ahn YT 등 2006; Lee YJ 등 2008).

한편, 국내에서 사용되고 있는 발효유용 유산균 종균의 경우 대부분 외국기업 제품의 수입에 의존하고 있는 실정으로 덴마크, 이탈리아, 미국 및 일본 등으로부터 수입하여 이용하고 있다(Park MS & Ji GE 2014; Kang CH 등 2017). 근래 들어 국내적으로 신규 분리 유산균에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있지만, 위와 같이 종균과 생균제의 경우 대부분 수입에 의존하는 것은 국내의 유산균 개발 관련 산업이 아직 활성화되지 못한 것인 만큼 종균 개발을 위한 연구가 요구된다.

김치는 세계적으로 우리나라의 대표적인 식물성 발효식품으로서 김치유래 유산균들에 대한 순수 분리 및 기능성들의 연구가 많이 이루어지고 있는데, 김치의 발효과정에 관련된 미생물 연구가 활발하게 진행됨에 따라 Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus 등 다양한 속의 유산균들이 김치 발효에 주로 관여한다는 사실이 밝혀졌고, 발효 초기에는 Leuconostoc 속이, 적숙기 이후에는 Lactobacillus 속이 우점한다(Lim CR 등 1989; Lee CW 등 1992; So MH & Kim YB 1995). 또한, 김치 유래 유산균은 김치의 종류와 관계없이 Lactobacillus 속이 발효후기에 왕성하게 증식한다고 보고되어 있다(Han HU 등 1990; Kim M & Chun J 2005). 이와 같이 김치 유래 유산균의 분리 동정 및 특성에 대한 연구는 L. sakei 383(Kim EA 등 2013), Leuconostoc 속과 Lactobacillus 속(Ko KH 등 2013), W. koreensis KO3(Jung MG 등 2016), L. plantarum(Moon GE 등 2015; Kim SK & Lim SD 2017) 등 다양하게 여러 보고가 진행되어 있는데, 발효 숙성김치를 시료로 사용한 경우가 대부분이었다. 식품공전에서 식품별 기준 및 규격의 김치류 유형에는 김칫속과 김치가 있으며, 김치속재료를 의미하는 김칫속은 ‘식물성 원료에 고춧가루, 당류, 식염 등을 첨가하여 혼합한 것으로 채소류 등에 첨가, 혼합하여 김치를 만드는 데 사용하는 것’으로 규정되어 있다. 일반적으로 배추김치 제조에 이용되는 김칫속 성분들은 무채, 고춧가루, 마늘, 젓갈, 양파, 생강, 소금 등 다양한 소재로 구성되며, 대부분 살균공정이 없이 원재료 그대로 사용된다. 본 발효가 진행되기 이전의 김치속재료에서는 다양한 균종이 존재할 수 있으므로 천연 미생물자원을 분리하기 위한 소재로 이용할 수 있는데 아직 이에 대한 연구는 미흡했다.

한편, 이와 같이 다양한 종류의 분리유산균이 연구되어 왔는데, 대부분 유산균 자체의 기능성 관련 연구들에 집중되어 왔으며 대표적인 축산식품 중 하나인 발효유에 적용가능성을 조사한 연구는 아직 미미한 실정이다. 이를 종균으로 이용할 수 있는 yogurt의 개발은 전통김치류 유래 유산균의 긍정적인 인식과 더불어 소비자들의 장 건강에도 좋은 효과를 줄 수 있다(Min KA & Chung CH 2016). 따라서 본 연구에서는 김치의 제조 원료인 김칫속으로부터 내산성과 내담즙성, 항균활성 등 probiotic 활성이 우수하고 또한, lactose를 포함하는 당과 우유단백질 분해능이 우수한 신규 유산균을 분리하고, 이를 이용한 요구르트의 특성 분석을 통해 새로운 유산균주로서 발효유 제조용 스타터로서의 이용가능성을 검토하였다.


재료 및 방법
1. 재료 및 시약

유산균 분리용 시료는 2021년 12월에 생산된 제조 1일차 태백하늘양념(Taebaek Farming Association Corporation, Taebaek, Korea)을 5℃ 냉장 상태로 당일 제공받아 사용하였으며, 발효유 제조용 환원유는 탈지분유(Seoul Dairy Cooperative, Seoul, Korea)를 구매한 후 정제수에 유고형분 12%(w/v)로 환원시켜 사용하였고, 분리 유산균의 비교를 위한 상업균주로서 요구르트 제조용 DVS(direct vat set) 타입의 종균인 Lactobacillus acidophilus CSLA(Culture Systems, Inc., USA)를 사용하였다. 유산균의 분리 및 저장에는 Bromocresol Purple agar(BCP, Eiken chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)와 de Man, Rogosa and Sharpe(MRS) broth 및 agar(Difco Laboratories, MD, USA)를 사용하였고, 항균활성 실험에는 MRS agar 및 BL agar(Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 분리유산균의 당발효 실험에는 API 50 CHL Kit(Bio Meriex Co., Lyon, France)을 사용하였고, 내산성과 내담즙성 실험에는 1 N HCl(Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)과 bile salts(Oxoid Ltd., Hants, England)을 사용하였다. 단백분해능 실험을 위한 L-tyrosine과 1 N folin reagent와 당분석용 표준품 등 그 외 분석에 필요한 시약은 Sigma-Aldrich Co.(USA)로부터 구입하여 사용하였다.

2. 우유단백질 분해 유산균의 스크리닝 및 당분해 특성 분석

김칫속 시료를 수거 당일 filter bag(BLD Science, USA)에 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)를 이용 10배 희석하여 stomacher(Hansol Tech. Co., Seoul, Korea)로 균질화한 후, MRS agar 배지를 이용하여 1% skim milk powder를 혼합한 modified MRS agar를 만들어 도말하고, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 우유단백질 분해에 의해 생성되는 clear zone을 형성하는 미생물을 분리하였다. 이어서 분리한 colony들을 BCP agar에 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하면서 배지를 노란색으로 변화시키는 colony들을 유산균으로 분리하고 생화학적 특성 분석 및 probiotic 활성을 시험하였다. 또한 API 50 CHL kit에 의한 49종의 탄수화물 이용성을 확인하였다. MRS agar에서 배양된 colony를 무균적으로 취하여 API 50 CHL medium에 현탁하고, 이 현탁액을 strip에 기포가 생기지 않도록 분주한 다음, 미네랄 오일을 적하하여 혐기조건을 형성하였으며, 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 후, 각각의 당 이용 패턴을 확인하였다. 스트립의 판독은 각 튜브별로 노란색으로의 색변화를 확인하여 negative(-), positive(+) 등으로 판정하였으며, API 50 CHL database(https://apiweb.biomerieux.com)를 이용하여 동정한 후 특징적인 우수균 3종을 선발하였다.

3. 분리균주의 형태, Catalase시험 및 생장 특성

분리균주의 형태는 MRS agar배지에서 37℃로 48시간 동안 배양한 다음 Gram staining을 통해 광학현미경(× 1,000)으로 관찰하였다. 생화학적 특성으로 catalase test는 단일 colony를 slide glass에 옮기고, 3% hydrogen peroxide(H202)를 1∼2방울 떨어뜨려 기포 발생 유무를 관찰하였으며, Anaerobic Jar(Difco, Michigan, USA)를 이용한 aerobic 및 anaerobic 조건과 15℃, 35℃ 및 45℃ 온도조건에서의 생장특성을 확인하였다.

4. 분리균주의 우유단백질 분해능 측정

분리균주의 우유단백질 분해능 측정은 Hull ME(1947)에 따른 tyrosine함량 측정 방법으로 실험하였다. 무지유고형분 10%의 환원탈지유를 사용하여 각각의 분리균주를 스타터로 접종하고 37℃에서 15시간 동안 발효시킨 다음 발효유 중 유리되는 tyrosine 함량으로 나타내었다. 발효유 시료를 whatman(No. 2) 여과지로 여과한 후 여과액 5 mL에 동량의 0.44 M trichlroacetic acid(TCA)로 침전시켜 30분간 방치시킨 다음, 상등액을 whatman여과지(No. 42)로 여과하여 여과액 1 mL와 0.44 M의 Na2CO3 2.5 mL를 혼합한 후 1 N Folin 시약 200 μL를 가하여 5분 동안 잘 흔들어 청색을 발색시켰다. 시료를 Spectrophotometer(Ultrospec 2000, Biochrom Ltd., Cambridge, England)로 660 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정값을 tyrosine standard의 값으로 환산하여 유리된 tyrosine 양을 μg/mL로 표시하였다.

5. 내산성 및 내담즙성

분리유산균의 내산성은 Clark PA 등(1993)의 방법을 응용하여 실시하였으며, 분리균주를 MRS broth에서 37℃로 24시간 동안 배양한 후, 1N-HCl로 보정하여 만든 pH 3.0 MRS broth에 각각 2%씩 접종하여 37℃에서 3시간 배양방법으로 테스트하였다. 배양된 시료는 멸균수에 십진 희석하고 1 mL 채취하여 MRS agar에 접종한 다음, 37℃에서 48시간 동안 배양하여 생성된 colony를 계수하고, 초기 균수와 배양 후의 균수를 비교하여 산성 pH에 대한 내성을 확인하였다. 내담즙성 확인은 Park SY 등(1996)의 방법에 준하여 시험하였으며, 분리균주 배양액을 0.3% bile salts를 첨가한 MRS broth에 각각 2%씩 접종하여 37℃에서 6시간 배양방법으로 테스트 하였다. 각각 배양이 종료된 샘플을 멸균수에 십진 희석하고 1 mL씩 채취하여 MRS agar에 접종한 다음, 37℃에서 48시간 배양하여 생성된 콜로니를 계수하고, 초기 균수와 비교하여 %로 나타내었다.

6. 16S rRNA 염기서열 및 계통도 분석

순수분리된 미생물의 단일 colony 샘플은 MRS 액체배지에서 24시간 동안 배양하여 genomic DNA를 추출하였으며, rRNA gene 증폭을 위해 유산균용 primer인 forward primer 27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC A-3’)와 reverse primer 1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)을 사용하였고, PCR 반응조건은 95℃에서 5분 동안 예비가열 후, 95℃에서 1분간 변성, 57℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 중합반응으로 30사이클을 반복하고, 마지막 사이클은 72℃에서 5분의 조건으로 PCR 과정을 수행하였다. PCR 반응산물은 ABI 3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하였으며(SolGent, Korea), 결정된 염기서열은 NCBI blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)의 database를 이용하여 nucleotide blast search를 통해 유전학적 동정을 실시하고, 다중염기서열을 비교하여 phylogenetic tree를 나타내었다.

7. 항균활성 측정

분리균주의 병원성 미생물에 대한 항균활성 테스트는 Paper disc agar diffusion method(Song YJ 등 2009)를 응용하여 Escherichia coli KCCM32396와 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC14028을 지시균으로 하였으며, 각각 Luria-Bertani(LB) broth(Difco Laboratories, MD, USA)와 Tryptic soy broth(TSB, Oxoid Ltd, UK)에 접종한 뒤 37℃에서 12시간 배양하여 활성을 높인 다음 피검균주로 사용하였다. 분리 유산균 배양액은 MRS broth에 분리균주를 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양한 다음 샘플로 사용하였으며, 상업균주인 L. acidophilus CSLA를 비교 균주로 사용하였다. MRS agar와 Brain Heart Infusion(BHI) agar(Difco, MD, USA)를 1:1로 혼합하여 평판배지를 만들고 충분히 굳힌 다음, 각 병원성 미생물 배양액을 고체배지 표면에 50 μL씩 spreader로 도말하였다. 표면을 충분히 건조시킨 후 멸균한 paper disk(6 mm, Advantec, Tokyo, Japan)를 올려 각 유산균 배양액 샘플 20 μL씩을 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 병원성 미생물에 대한 clear zone의 형성 여부를 확인하였으며, 형성된 clear zone 직경의 mm 크기로 나타내었다.

8. 분리유산균을 이용한 발효유 제조

발효유 제조용 스타터는 최종 선발된 2개 유산균종 및 상업균주로서 요구르트 제조용 DVS starter인 L. acidophilus CSLA를 이용하였으며, MRS broth에 증균한 후 살균 탈지유에 1.0% 접종하고 37℃에서 15시간 동안 배양하여 bulk starter를 제조하여 사용하였다. 발효유는 무지유고형분 12% 농도로 탈지분유를 이용하여 환원탈지유를 제조한 후 sucrose를 2.5% 혼합하고 85℃에서 20분간 살균하여 발효유 제조용 살균유로 사용하였다. 살균유를 37℃로 냉각한 다음 각각의 bulk starter를 3.0%(v/v) 첨가한 후 37℃ incubator에서 각각 적정산도가 0.65% 이상 수준에 이르러 커드가 형성될 때까지 발효시켰다. 이를 300 rpm으로 1분간 교반하여 커드를 분쇄하고 5℃로 냉장보관하면서 분석시료로 사용하였다.

9. 발효유의 pH, 적정산도 및 유산균수 측정

발효유의 pH 변화는 pH meter(Orion 3 Star Plus, USA)를 이용하여 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었고, 적정산도 변화는 시료 9 g을 취하여 0.1 N NaOH 용액으로 pH 8.3이 될 때까지 중화 적정하여 소비된 0.1 N 수산화나트륨 용액의 mL 양으로부터 젖산을 정량하였다. 유산균수의 측정은 배양종료 후 5℃ 냉장저장 시료를 이용하여 5일 간격으로 20일 동안 조사하였으며, 시료를 멸균수로 10배 희석방법을 이용하여 10—7∼10—8 CFU/mL 수준으로 희석한 다음, BCP agar배지에 pouring 방법으로 1 mL를 혼합하고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 생성된 colony를 Log CFU/mL로 나타내었다.

%=V×0.009×fS×100
  • V = 0.1 N NaOH 소비량(mL)
  • f = 0.1 N NaOH의 factor
  • S = 시료량(g)
  • * 0.009: 0.1 N 수산화나트륨 용액 1 mL에 해당하는 젖산량
10. 발효유의 점도 및 Syneresis 측정

발효유의 점도는 APHA(1978) 방법을 응용하여 분석하였으며, 배양이 완료된 발효유를 300 rpm으로 1분간 교반하여 커드를 분쇄한 후, 5℃에서 24시간 동안 저장된 시료를 Brookfield-Viscometer(Model DV-II+, Brookfield Engineering Lab. Inc., USA)를 이용하여 측정하였다. 5∼10℃의 시료 200 mL를 250 mL용 비이커에 취하여 Spindle No. 63으로 12 rpm에서 1분 후의 점도를 측정하였으며, 3회 반복한 후 cp(g/100 (cm·s))값을 평균치로 나타내었다. Syneresis는 Keogh MK & O’Kennedy BT(1998)의 방법에 따라 발효유 30 g을 50 mL conical tube에 취하고 5℃에서 10일 동안 보관 후 1,500 rpm, 10분간 원심분리하여 분리된 상등액의 중량(g)을 %로 계산하였다.

11. 발효유의 EPS 생성량 정량 분석

분리유산균을 이용하여 제조한 후 5℃에서 24시간 저장한 발효유로부터 crude-EPS(exopolysaccharide) 생성량을 De Vuyst L 등(1998)Hwang SK(2007)의 방법을 응용하여 분석하였다. 시료를 12,000×g으로 20분간 원심분리하고, 분리된 상등액을 0.45 μm syringe filter로 여과한 다음, 상등액의 4배량의 ethanol(95%)을 가하여 5℃에서 20시간 동안 침전시켰다. 이어서 8,000×g으로 10분간 원심분리 방법으로 침전물을 회수한 다음 105℃ dry oven(Seki Science Co., Changwon, Korea)을 이용하여 건조 중량을 측정하였다.

12. 발효유의 유리당 정량 분석

발효유 중의 유리당 정량은 Richmond ML 등(1982)Kim CH & Kwak HS(1993)의 방법을 응용하여 분석하였다. 발효유를 증류수로 10배(w/w) 희석하여 시료로 사용하였으며, 시료 5 g에 12% TCA용액 1 mL를 혼합한 후 5,000×g에서 5 min 동안 원심분리하고, 분리된 상등액을 nylon 0.45 μm membrane filter(Filter Technology, USA)로 여과하여 분석시료로 하였다. 기기분석은 HPLC-RID(Shimadzu, Japan)를 사용하여 lactose, glucose 및 sucrose에 대하여 정량 분석하였다. Detector는 Refractive Index Detector(Shimadzu, Japan)를 사용하였으며, column은 Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6 × 250 mm, Japan)를 사용하고 오븐의 온도는 30℃를 유지하였다. 시료는 10 μL를 주입하였으며, 이동상은 acetonitrile과 water를 80:20(v/v)의 비율로 사용하여 1.0 mL/min의 유속으로 수행하였다.

13. 통계분석

모든 실험은 3회 반복 실험을 기본으로 하였으며, 그 결과는 SPSS 24.0(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±표준편차로 나타내었다. 시료들 간의 유의성 검정을 위해 분산분석을 실시하였으며, Duncan’s multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.


결과 및 고찰
1. 유산균 분리

김칫속 시료 25 g을 225 mL의 멸균생리식염수로 스토마커 필터백에서 희석한 후, MRS agar배지에 백금이로 획선 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 유백색의 집락 중 크게 형성된 45 colony를 임의 선별하였다. 또한 BCP agar에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양을 통해 노란색 환을 형성하는 유산균임을 확인하였으며, 이들을 다시 1% 탈지분유를 첨가한 modified MRS agar배지에 각각 paper disc 방법으로 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 우 유단백질 분해에 의해 생성되는 clear zone을 크게 형성하는 10 colony를 순수분리하였다. 이어서 분리균들을 대상으로 API 50 CHL kit에 의한 49종의 탄수화물 이용성을 분석하였으며, 당분해 결과를 API 50 CHL database에 입력하여 특성을 비교·분석하였다. 당분해 특성 분석에서 서로 다른 결과를 보이며 97% 이상의 유사도로 동정된 AH01(Lactobacillus plantarum), SS03(Lactococcus lactis subsp. lactis)와 LM07(Leuconostoc mesenteroides) 등 3개 균종을 선발하고 생화학적 특성 분석 및 probiotic 활성 시험에 이용하였으며, 이들 중 AH01 1개 균주에서는 lactose 분해능을 보여 우유 발효유 제조에 적합할 것으로 판단되었다.

2. 분리균주의 유전학적 동정 및 계통도 분석

분리균주의 DNA를 추출하고 16S rRNA gene분석을 통한 유전학적 동정을 실시하여 당분해 특성 결과와 함께 확인하였으며, Table 1과 같이 AH01은 L. plantarum, SS03은 L. lactis ssp. lactis, LM07은 Leu. mesenteroides로 99% 이상의 상동성을 보이며 당분해 특성과 같은 결과로 동정되었다. 본 연구에서는 우유 요구르트 제조용 스타터로서 활용할 수 있는 특징균을 선발하기 위해서, API 50 CHL를 이용한 당분해 특성에서 lactose에 양성 반응을 보인 AH01(L. plantarum)을 우수균주로 최종 선발하고 염기서열 비교에 따른 phylogenetic tree를 Fig. 1에 나타내었다.

Table 1. 
Identification and identity percentage of selected strains by API 50 CHL kit and 16S rRNA analysis
Strains Identification API 50 CHL 16S rRNA
27F 1492R
AH01 Lactobacillus plantarum 99.9% 99% 99%
SS03 Lactococcus lactis subsp. lactis 98.6% 99% 99%
LM07 Leuconostoc mesenteroides 97.4% 100% 100%


Fig. 1. 
Phylogenetic tree of L. plantarum AH01 isolated from kimchi seasoning.

3. 분리균주의 형태, Catalase 시험 및 생장 특성

분리균주의 형태 및 생화학적 특성은 Table 2와 같은 결과를 보였다. MRS agar배지에서 37℃로 48시간 동안 배양한 다음 Gram staining을 통해 광학현미경으로 관찰한 결과, 모두 Gram(+)이면서 1개 균종의 rod와 2개 균종의 coccus형태를 확인하였다. 생화학적 특성으로는 catalase test와 혐기 Jar를 이용한 aerobic 및 anaerobic 조건에서의 생장특성을 확인한 결과, 모두 catalase(-)이었으며 산소유무와 상관없이 잘 생장하였다. 또한 pH 6.45의 MRS broth에 분리균주를 접종한 후 산 생성에 의한 pH저하로 생장성을 판단하였으며, 온도별로 45℃와 35℃는 18시간, 15℃에서는 72시간 동안으로 배양시간을 다르게 적용하면서 생장여부를 조사하였다. 45℃에서는 분리균주 모두 거의 생장하지 못하였고, 35℃에서는 배양 18시간 후 AH01균주는 pH 4.36, SS03균주는 pH 4.40, LM07균주는 pH 4.57로 잘 생장하는 중온균의 특성을 보였으며, 이들 중 AH01균주가 비교적 빠르게 생장하였다. 또한, 15℃에서는 배양 72시간 후 AH01균주는 pH 4.65, SS03균주는 pH 4.87, LM07균주는 pH 4.92로 양호한 생장이 진행되었다.

Table 2. 
Physiological characteristics of selected strains isolated from kimchi seasoning
Strains AH011) SS032) LM073)
Morphology rod coccus coccus
Gram staining (+/—) + + +
Catalase test (+/—)
Aerobic/anaerobic +/+ +/+ +/+
Growth at 15℃ + + +
Growth at 35℃ + + +
Growth at 45℃
1) AH01: Lactobacillus plantarum AH01.
2) SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03.
3) LM07: Leuconostoc mesenteroides LM07.

4. 유단백질 분해능 측정

앞서 probiotic 특성이 우수한 colony를 선별하는데 탈지분유를 1% 첨가한 modified MRS배지를 이용하여 투명환의 생성을 확인한 바 있으며, 선발 유산균 3종에 대한 우유단백질 분해능을 유리되는 tyrosine 함량으로 나타내었다. MRS broth에서 계대배양한 분리균주를 10% 환원탈지유에 2%씩 접종한 후 37℃에서 15시간 동안 배양 후의 유리된 tyrosine 함량으로 측정하였다. 분리 유산균의 tyrosine함량은 Fig. 2와 같으며, AH01이 131.4±11.5 μg/mL, SS03은 114.1±3.5 μg/mL, 그리고 LM07은 92.1±6.8 μg/mL 수준으로 나타나, 당분해 특성에서 L. plantarum으로 동정되었던 AH01이 가장 우수한 단백질 분해능을 보였다. 아미노산은 유산균의 생장에 필요한 성분이지만 우유 중에는 소량 존재한다. 유산균은 E. coli나 yeast와 비교했을 때 낮은 proteinase 생산활성을 지니지만 우유에 존재하는 casein을 peptide 수준이나 아미노산 수준까지 분해시켜 이용할 수 있다. 유산균은 종류에 따라 다양한 종류의 단백질 분해효소를 생산하는데 endopeptidase, aminopeptidase, dipeptidase 등이 알려져 있으며, 유산균의 단백질 가수분해 활성은 궁극적으로 발효유제품의 풍미, 조직감 및 쓴맛 등에 결정적인 영향을 미칠 수 있다(Law J & Haandrikman A 1997). 이런 측면에서 발효유 제조용 종균의 개발 시에는 효소활성 및 유단백질 분해능이 중요한 결정요인 중 하나로 포함되어야 할 필요성이 있다. Cho YH & Oh SJ(2010)는 유제품, 김치 등으로부터 유산균을 분리하여 우유 casein을 분해시켜 배양 상등액에 존재하는 serine의 함량을 측정한 결과 세포외 효소에 의한 proteolytic 활성은 L. plantarum 균주에서 가장 높게 나타났다고 하였는데, 본 연구에서도 L. plantarum 균종이 가장 높은 단백질 분해능을 나타내 유사한 결과를 보였다.


Fig. 2. 
Tyrosine contents of selected strains isolated from kimchi seasoning in 10% reconstituted skim milk at 37℃ for 15 hr.

AH01: Lactobacillus plantarum AH01, SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03, LM07: Leuconostoc mesenteroides LM07.



5. 내산성 및 내담즙성

분리한 균주들의 probiotic 활성 측정으로 내산성 및 내담즙성을 실험하였다. 유산균의 probiotics 작용을 위해서는 내산성 및 내담즙성을 가지며 위장관을 포함하는 소화관내에서 서식 가능해야 하고, 장관내 상피세포에 정착하여 증식하면서 유해미생물에 대한 항균작용 등의 특성이 필요하다(Sanders ME 2003; Mainville I 등 2005; Schillinger U 등 2005). Table 3에서 보이는 것과 같이 AH01과 SS03 2개 균주는 내산성에서는 70% 이상 및 내염기성에서는 80% 이상의 생존율을 나타내었으며, LM07 균주는 각각 25% 및 30% 수준으로서 상대적으로 낮은 생존률로 각 균주별 큰 차이를 보였다. 전체적으로 내산성보다는 내염기성에서 비교적 우수한 특성을 보였으며, 이는 김치유래 유산균들이 내산성뿐만 아니라, 매우 우수한 내담즙성을 나타내었다는 Lim YS 등(2019)의 연구와 유사한 결과이다. 또한, 김치유래 유산균은 우수한 내담즙성과 내산성을 지닌다는 다수의 연구결과들이 보고되었는데(Lim SM & Im DS 2009; Lee HJ 등 2010; Cho YH 등 2013), 일정농도의 식염을 함유하는 제품 특성과, 또한 숙성이 진행됨에 따라 산성도가 높아지는 숙성김치의 특성을 고려할 때 발효과정에서 산성에 강한 유산균들이 우점하면서 나타난 결과로 볼 수 있다. 김칫속 유래 유산균들이 생장하면서 김치의 숙성과정에 관여하는 것으로 볼 수 있는데, 이와 같이 김치유래 유산균들의 내산성과 내염기성 모두에서 우수한 특성은 발효식품 제조를 위한 종균 및 probiotics 건강기능식품으로서 폭넓은 이용가능성을 기대할 수 있다.

Table 3. 
Survival of selected strains in HCl solution (pH 3.0, 3 hr) and bile salts solution (0.3%, 6 hr)
Strains Survival (%)
pH 3.0/3 hr Bile salts 0.3%/6 hr
AH011) 76.9±5.6% 98.7±4.5%
SS032) 70.5±6.2% 80.0±4.7%
LM073) 25.0±2.1% 31.3±6.6%
1) AH01: Lactobacillus plantarum AH01.
2) SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03.
3) LM07: Leuconostoc mesenteroides LM07.
All values are Means±S.D. (n=3).

6. 선발 유산균의 병원성균에 대한 항균활성

분리균주의 항균활성 테스트는 tryptic soy 고체배지에 paper disk method(6 mm)를 이용하여 대조군으로 상업균주인 L. acidophilus CSLA과 함께 비교하였으며, 대표적인 식중독 유발균으로 지목되고 있는 S. Typhimurium ATCC14028와 E. coli KCCM32396 2종의 병원성 미생물에 대하여 형성된 clear zone의 size를 확인하였다. 실험 결과, Table 4Fig. 3에서 보이는 것과 같이 분리균주 AH01는 병원성균 2종 모두에 대하여 11∼13 mm의 저해환을 형성하여 모두 9 mm 크기의 저해환을 보인 상업균주 L. acidophilus CSLA보다 우수한 항균특성을 보였으며, E. coli KCCM32396보다는 S. Typhimurium ATCC14028에서 높은 저해능을 보였다.

Table 4. 
Antimicrobial activity of L. plantarum AH01 isolated from kimchi seasoning
Pathogens Species
L. acidophilus
CSLA
L. plantarum
AH01
S. Typhimurium ATCC14028 9 mm1) 13 mm
E. coli KCCM32396 9 mm 11 mm
1) Inhibitory clear zone size.


Fig. 3. 
Antimicrobial activity of L. plantarum AH01 isolated from kimchi seasoning.

(A) S. Typhimurium ATCC14028, (B) E. coli KCCM32396.



일반적으로 유산균은 젖산을 생성하여 산도를 낮춤으로써 병원성 세균의 생육을 억제하며, bacteriocin 등의 항균물질을 생성하여 항균작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Kaur IP 등 2002). 김치 소재 등으로부터 유래된 유산균들 중 L. plantarum에 대한 항균성은 다양하게 보고되어 있으며(Song YJ 등 2009; Park JH 등 2013; Yang SJ 등 2019), 그와 같이 선발된 AH01는 유산균 생균제 또는 yogurt 제조용 종균으로 사용시 유해균의 증식을 억제하여 probiotics 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

7. 발효유의 pH, 적정산도 및 유산균수

김칫속으로부터 분리한 유산균의 우유 발효유 제조 가능성을 확인하기 위하여 DVS형태의 상업균주인 L. acidophilus CSLA 균주 및 분리유산균으로서 AH01과 SS03을 각각 starter로 하여 37℃에서 발효하였으며, 적정산도가 0.65% 수준에 도달하여 커드가 잘 형성되었을 때 배양을 종료하고 5℃로 냉장 저장하면서 분석한 결과는 Table 5와 같다. 발효유의 pH와 적정산도에서 상업균주와 선발균주 AH01은 각각 pH 4.45, pH 4.52와 0.72%, 0.71%로 유사한 수준을 보였으며, 선발균주 SS03은 pH 4.88과 산도 0.61%로 산생성이 다소 적은 차이를 보였다. 유산균수 측정에서는 선발균주 SS03의 경우 8.14 Log CFU/mL로 농후발효유 제품유형의 기준규격인 8.0 Log CFU/mL 이상은 충족하였지만 비교적 낮게 측정되었고, 이에 비해 선발균주 AH01과 상업균주 CSLA를 이용한 경우 8.85∼8.72 Log CFU/mL로 유사하면서 비교적 높은 수준의 생균수로 측정되었다. 이와 같이 분리유산균 AH01은 상업균주와 유사한 수준의 생균수와 발효특성을 보였다.

Table 5. 
pH, titratable acidity and viable cell counts of yogurts fermented by strain isolated from kimchi seasoning and commercial strain
Items Yogurt samples
CSLA1) AH012) SS033)
pH 4.45±0.03 4.52±0.03 4.88±0.09
Titratable acidity (%) 0.72±0.01 0.71±0.02 0.61±0.02
Viable cell counts (Log CFU/mL) 8.85±0.20 8.72±0.18 8.14±0.28
All values are Means±S.D. (n=3).
1) CSLA: Lactobacillus acidophilus CSLA.
2) AH01: Lactobacillus plantarum AH01.
3) SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03.

8. 발효유의 Exopolysaccharide(EPS) 생성, Viscosity 및 Syneresis

분리유산균 및 상업용 유산균으로 제조한 발효유 시료를 5℃에서 24시간 동안 저장 후 crude EPS 생성량을 측정한 결과는 Table 6과 같이 선발균주 AH01과 상업균주 L. acidophilus CSLA는 각각 1.93%와 1.98%로 큰 차이를 보이지 않고 유사한 생성량을 보였으며, 선발균주 SS03은 1.12% 다소 낮은 값으로 차이를 보였다. Min KA & Chung CH(2016)은 4% sucrose를 첨가한 발효유에서 2∼4%의 EPS의 생성으로 본 연구에 비하여 다소 높은 수준을 보였는데, 이는 발효유에 사용된 유산균의 다당체 생성 특성의 차이로 볼 수 있다. 또한 Sarwat F 등(2008)은 다당체 생성 유산균의 특성 연구에서 sucrose 농도가 15%까지는 EPS가 비례적으로 증가한다고 하였는데, 본 연구에서도 sucrose의 2.5% 배합이 EPS의 형성에 긍정적인 영향을 미친 것으로 사료된다.

Table 6. 
EPS yields, viscosity and syneresis of yogurts fermented by strain isolated from kimchi seasoning and commercial strain
Items Samples
CSLA1) AH012) SS033)
EPS yield (%) 1.98±0.04a4) 1.93±0.13a 1.12±0.07b
Viscosity (cp) 4,840±72a 4,970±54a 945±96b
Syneresis (%) 6.1±1.4b 7.5±2.3b 21.1±3.4a
All values are Means±S.D. (n=3).
1) CSLA: Lactobacillus acidophilus CSLA.
2) AH01: Lactobacillus plantarum AH01.
3) SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03.
4) Different superscripts within the same row are significantly different by Duncan’s multiple range test at p<0.05.

선발균주 AH01과 상업균주 L. acidophilus CSLA의 syneresis는 각각 7.5%와 6.1%로 유사하게 양호한 품질 특성을 보였다. Min KA & Chung CH(2016)은 sucrose를 2∼4% 첨가하고 김치유래 다당체 생성균으로 요구르트를 제조하고, 저장 12일차 syneresis를 측정한 결과 9.5∼14.0%의 결과를 얻었으며, EPS가 카제인 단백질과의 상호작용으로 syneresis를 막아준다고 하였다. 본 연구에서도 유사한 수준을 보였는데, 발효 중 생산된 일정 수준의 EPS가 syneresis의 예방에 작용한 것으로 생각된다. 점도는 선발균주 AH01에서 4,970 cp의 가장 높은 수준으로 측정되었고, 선발균주 SS03에서는 945 cp의 매우 낮은 수준으로 측정되었는데, 시료간 EPS의 생성량 및 syneresis 발생형태와 같은 경향을 보인 것이다. 발효유의 점도에 영향을 미치는 인자로 유산균이 생성하는 유기산, 총 고형분 함량, 유단백질 가수분해, 사용균주의 점질물 형성능 등으로 보고되어 있다(Rasic JL & Kurmann JA 1978). 본 연구에서도 syneresis에서의 경향과 같이 발효 중 생산된 일정 수준의 EPS가 점도에 영향을 준 것으로 사료된다.

9. 발효유의 유리당 함량 분석

우유에 함유되어 있는 주요 성분들 중에서 유당은 소화능력이 떨어지는 소비자에게는 유당불내증을 유발할 수도 있는 성분으로서 유당을 제거하거나 분해시킨 형태의 우유제품이 상품화되고 있기도 하다. 발효유는 유산균의 효소 작용에 의해 유당을 glucose와 galactose로 분해하여 유당 농도를 낮춰줄 수 있으며, 유산균의 종류에 따라 효소활성은 다르다. Liang ZQ 등(2011)은 김치에서 분리한 L. plantarum 그룹이 유당분해효소인 β-galactosidases를 생성한다고 보고하였는데, 본 연구에서 최종 선발된 AH01 유산균도 당분해특성 조사에서 lactose분해능을 갖는 같은 결과가 확인된 바 있다. 선발된 균주를 이용한 발효유의 유리당 함량을 분석한 결과 Table 7에서 보이는 것과 같이 lactose 함량에서 차이를 보였다. 원유의 성분조성에서 유당은 약 4.9%(w/v) 수준을 함유하고 있는데, 분리유산균 AH01을 이용한 발효유의 경우 4.56±0.17% 수준으로 감소하여 상업균주인 L. acidophilus CSLA의 4.48±0.11와 유사한 수준을 보였으며, 분리균주 SS03를 이용한 발효유의 경우에서는 lactose가 분해되지 않았다. Sucrose의 경우는 각 시료구에서 1.71∼1.40%로 분석되었는데, 배양액 준비시에 2.5%씩 혼합된 sucrose가 일정 비율씩 모든 시료에서 감소된 것을 확인할 수 있고, glucose의 경우는 검출되지 않았다. 이러한 결과들은 발효유 중의 유당함량은 3.70%, 3.20∼4.25%를 보였으며 포도당은 미량 수준을 유지하거나 검출되지 않았다는 보고들과 유사한 결과이다(Richmond ML 등 1987; Cho YH 등 2013; Jung JK 등 2015).

Table 7. 
Contents of glucose, sucrose and lactose in yogurts fermented by strain isolated from kimchi seasoning and commercial strain (Unit: g/100 g)
Samples Glucose Sucrose Lactose
CSLA1) ND4) 1.45±0.13 4.48±0.11
AH012) ND 1.71±0.16 4.56±0.17
SS033) ND 1.40±0.10 4.94±0.08
All values are Means±S.D. (n=3).
1) CSLA: Lactobacillus acidophilus CSLA.
2) AH01: Lactobacillus plantarum AH01.
3) SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03.
4) ND: Not detected.

10. 발효유의 저장중 유산균수 변화

발효유의 저장 중 분리유산균의 생균수 변화를 확인한 결과 Fig. 4와 같이 나타났다. 그림에서 보이는 것과 같이 최종 선발 유산균인 AH01을 이용한 발효유의 경우 상업균주 L. acidophilus CSLA와 같이 저장 20일 동안 유산균 생균수는 초기균수와 유사하게 8.70 Log CFU/mL 이상의 안정적인 수준으로 유지되었다. 일반적으로 발효유 제품들의 유통기한이 15∼20일 동안으로 설정되어 운용되는 것을 고려할 때 생균수에 있어서 우수하게 유지되는 것을 알 수 있다. 유산균은 생균으로 섭취하여 체내에서 생성되는 유기산 등에 의해 유해균의 증식을 억제하는 probiotics로서 이용될 수 있는데(Shanahan F 2004), 이러한 결과는 김칫속 유래 유산균주, 특히 L. plantarum 균종이 probiotics로서 우유 발효용 종균으로 적용가능성이 높은 것을 나타낸다.


Fig. 4. 
Changes in viable cell counts of yogurts fermented by strain isolated from kimchi seasoning and commercial strain during storage period.

CSLA: Lactobacillus acidophilus CSLA, AH01: Lactobacillus plantarum AH01, SS03: Lactococcus lactis ssp. lactis SS03.




요약 및 결론

발효김치 제조에 주요 재료로 이용되는 김칫속으로부터 lactose 분해능과 우유단백질 분해능을 갖는 유산균으로서 AH01(L. plantarum)을 분리 동정하였으며, 이를 이용한 요구르트의 품질 특성 분석을 통하여 발효유용 starter로서의 이용 가능성을 조사하였다. 최종 선발 유산균인 AH01은 rod형태이면서 중온균의 특징을 보였으며, probiotics 특성으로서 내산성 및 내담즙성을 측정한 결과, AH01균주가 내산성 76.9%, 내염기성 98.7%로 다른 선발균들에 비하여 우수한 생존성을 보였고, 내염기성에서 비교적 더 우수하였다. 10% 환원탈지유를 이용한 유단백질 분해능 측정에서는 AH01균주가 131.4 μg/mL로 92.1 및 114.1 μg/mL를 보인 다른 선발 균주들에 비하여 높은 분해활성을 나타내었다. 항균활성으로서 S. Typhimurium ATCC14028과 E. coli KCCM32396 등 2종의 병원성균에 대한 저해특성을 측정한 결과, 상업균주인 L. acidophilus CSLA가 9 mm의 clear zone을 형성한 것에 비하여 11∼13 mm로 우수한 항균활성을 보였다. E. coli KCCM32396보다는 S. Typhimurium ATCC14028에서 더 우수한 항균성이 나타났다.

유고형분 12% 환원탈지유를 이용하여 선발균주인 AH01과 SS03 및 상업균주로서 L. acidophilus CSLA를 스타터로 37℃에서 배양하여 요구르트를 제조하고 품질 특성을 확인하였다. 적정산도는 선발균주 AH01이 0.71%, 상업균주 L. acidophilus CSLA는 0.72%로 유사한 수준을 보였으며, 선발 균주 AH01을 이용한 발효유의 유산균수는 농후발효유의 8.0 Log CFU/mL(1.0 × 108 CFU/mL) 기준을 충족하는 8.72 Log CFU/mL로서 8.85 Log CFU/mL를 보인 상업균주 L. acidophilus CSLA와 유사하게 높은 수준으로 나타났다. 요구르트의 유리당 함량 분석에서 모든 시료에서 glucose는 검출되지 않았고, lactose함량은 선발균주 SS03에서는 감소되지 않았으나, AH01과 상업균주 L. acidophilus CSLA에서는 4.48∼4.56% 수준으로 유사한 감소효과를 보였다. 5℃에서 저장하면서 20일 동안 유산균 생균수 변화를 조사한 결과, AH01과 상업균주 L. acidophilus CSLA에서 8.70 Log CFU/mL 이상의 안정적인 수준으로 생균수가 유지되었다. 이상과 같이 김칫속 유래 AH01 선발 유산균은 비교적 높은 항균활성을 가지면서 상업균주 수준의 산생성 및 유당분해 특성과 생균수 유지를 보였으며, 발효유 종균으로 사용 가능할 것으로 판단되었다.


Acknowledgments

본 연구는 농업회사법인(주)태백의 지원으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.


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