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시료 된장제조에는 낱알형 개량식 메주(문화메주, 경북), 정제염[(주)일천, 전북], 국내산 더덕, 도라지, 우엉, 연근분말은 자연초(www.jhurb.com)에서 구입하여 사용하였다. Catechin, epicatechin, rutin, caffeic acid, p-coumaric acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, hydroxybenzoic acid, ferulic acid, sinapic acid, syringic acid, Folin-Ciocalteu reagent, sodium nitrite, aluminium chloride hexahydrate, gallic acid, quercetin, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azinobis-(3-ethyl benzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS) diammonium salt, potassium persulfate는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Chromatography에는 HPLC급 water와 acetonitrile을 Duksan(Ansan, Korea)에서 구입하였다.

뿌리채소 분말을 첨가한 된장은 Lee KH 등(2016)의 방법을 참고로 개량메주:소금:물을 각각 33:13:54의 비율로 혼합하여 제조하였다. 제조에 사용한 개량메주는 증자한 대두에 Aspergillus oryzae를 접종하고 발효시킨 후 건조한 것이며 발효가 잘 되도록 믹서기[HM-331(NW), Hanil, Korea]로 분쇄하였다. 다음 분쇄한 메주 1,015 g과 뿌리채소 분말 140 g에 소금물(물 1,890 g에 소금 455 g을 넣어 완전히 용해)을 넣어 균일하게 혼합하였다. 대조구의 경우, 메주 1,155 g을 소금물과 혼합하여 제조하였다. 이어 미리 알코올로 소독해 둔 투명용기(PCT 소재, 1 L용량)에 700 g씩 담아 30℃의 incubator(HB-103-2, Hanback, Korea)에서 40일간 발효하면서 10일 간격으로 채취하여 시료로 사용하였다. 예비실험에서 뿌리채소 분말 첨가량은 원료 총중량(3.5 kg)의 3∼5%가 되도록 하여 된장을 제조한 결과, 4% 첨가 시 적당한 되기의 된장제조가 가능하여 4%(140 g)로 결정하였다. 이하 더덕(deodeok)된장, 도라지(ballon flower root)된장, 우엉(burdock root)된장, 연근(lotus root)된장으로 하였다.

실험에 사용한 시료액은 된장 2 g에 60% 에탄올 8 mL를 가하고 실온에서 혼합기(SLRM-3, Seolin Bioscience, Korea)를 이용하여 100 rpm에서 1시간 추출한 다음 여과지(No.2, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과한 여액을 10 mL 메스플라스크로 표정하였다. 시료액은 총 polyphenol, 총 flavonoid, 항산화능 측정에 추가적으로 희석하지 않고 사용할 수 있는 농도가 되도록 예비실험을 통해 결정하였다. 시료 HPLC 분석에는 표정한 용액을 0.45 μM membrane filter로 여과하여 사용하였다.

모든 실험결과는 3회 반복 측정하여 평균값과 표준편차로 나타내었다. 통계처리는 SPSS 25.0 version을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서는 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 유의성을 검정하였다.

뿌리채소 된장의 발효 기간 중 flavonol 조성 및 함량의 변화는 Fig. 1에, 총 flavonol 함량은 Table 1에 나타내었다. Catechin, epicatechin, rutin의 3종 flavonol 화합물이 시료 된장에서 검출되었는데, 이들 화합물들은 발효 기간이 증가함에 따라 점차적으로 증가하였다(Fig. 1). Catechin의 경우, 제조 당일에 대조구는 뿌리채소 된장보다 유의적으로 높았으나(p<0.05), 40일째에는 우엉, 연근된장 > 도라지된장 > 더덕된장, 대조구의 순으로 뿌리채소 된장이 대조구보다 높은 경향을 보였다. Epicatechin도 40일째에는 우엉, 연근된장 > 도라지된장, 대조구 > 더덕된장의 순으로 높아 catechin과 동일하게 우엉, 연근된장의 함량은 유의적 차이 없이 시료 중 가장 높았다(p<0.05). Rutin의 경우, 연근된장의 함량은 제조 당일부터 37일경까지 가장 높았으나, 이후 대조구가 급격히 증가해 40일째에는 시료 된장 중 가장 높게 나타났고, 다음은 연근, 우엉, 더덕된장이 유의적 차이 없이 높았고, 도라지된장은 가장 낮았다(p<0.05).

Fig. 1. 
Changes in catechin, epicatechin, rutin content of doenjang added with root vegetable powder and control doenjang during fermentation at 30℃ for 40 days.

Control: doenjang without root vegetable powder, Deodeok: doenjang with deodeok powder, Balloon flower root: doenjang with balloon flower root powder, Burdock root: doenjang with burdock root powder, Lotus root: doenjang with lotus root power. Data are expressed as mean±S.D. (n=3). ^a∼d Means with different superscripts in the same fermentation time are significantly different at the p<0.05 Duncan’s multiple range test.

Lee KH 등(2016)은 자연 발효시킨 대조구와 Bacillus subtilis KACC 15935 및 Bacillus subtilis HJ18-9을 접종하여 낱알형 개량메주를 만들어 3종의 된장을 제조하였다. 이들 Bacillus 균주를 달리한 된장에서 epigallocatechin, catechin, epicatechin 및 이의 gallate 총 6종의 flavonol 화합물이 검출되었는데, epicatechin 함량이 가장 높았다. 본 연구의 시료된장은 Aspergillus oryzae를 접종하여 만든 메주를 사용하여 상기 연구의 자연발효, Bacillus 균주로 제조한 메주와 종균의 차이는 있으나, 본 연구에서도 채소분말을 첨가하지 않은 대조구 경우 epicatechin 함량은 catechin보다 높은 경향을 보여 유사하였다.

Catechin, epicatechin 및 rutin 함량을 합한 총 flavonol 함량은 발효 기간이 증가함에 따라 증가하여 40일째에는 우엉, 연근된장이 유의적 차이 없이 가장 높았고, 다음은 대조구, 도라지, 더덕된장의 순으로 높았다(Table 1).

뿌리채소 된장의 발효 기간 중 phenolic acid의 조성 및 함량의 변화는 Fig. 2에, 총 phenolic acid 함량은 Table 2에 나타내었다. Caffeic acid, chlorogenic acid, syringic acid, sinapic acid, dihydroxybenzoic acid, hydroxybenzoic acid, p-coumaric acid, ferulic acid의 8종 phenolic acid가 시료 된장에서 검출되었으며, 이들 phenolic acid는 발효 기간이 증가함에 따라 증가하는 경향이었다.

Fig. 2. 
Change in phenolic acid contents of doenjang added with root vegetable powder and control doenjang during fermentation at 30℃ for 40 days.

Control: doenjang without root vegetable powder, Deodeok: doenjang with deodeok powder, Balloon flower root: doenjang with balloon flower root powder, Burdock root: doenjang with burdock root powder, Lotus root: doenjang with lotus root power. Data are expressed as mean±S.D. (n=3). ^a∼d Means with different superscripts in the same fermentation time are significantly different at the p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

우엉된장은 caffeic acid, chlogenic acid, syringic acid, sinapic acid 함량이 다른 된장보다 현저히 높은 것으로 나타났다(p<0.05). 특히 caffeic acid의 함량이 가장 높았는데, 제조 당일에도 68.15 μg/g으로 다른 된장 1.26∼6.38 μg/g보다 11∼54배나 높았고, 30일에는 156.52 μg/g까지 증가하다 이후 감소하였다. 우엉된장 중의 caffeic acid는 주로 우엉으로부터 유래한 것으로 사료되는데, 우엉 중에는 caffeoylquinic acid(Liu J 등 2012), chlorogenic acid, caffeic acid(Chen FA 등 2004)가 다량 함유되어 있는 것이 보고되었다. 한편, 대조구에는 dihydroxybenzoic acid 함량이 가장 많았고, chlorogenic acid, sinapic acid의 함유량도 높은 것으로 나타났다.

8종 phenolic acid 함량을 합한 총 phenolic acid 함량에 있어서 대조구와 뿌리채소 된장이 다른 경향을 보였는데, 대조구는 30일째까지 증가하다가 이후 변화가 없었으나, 뿌리채소 된장의 함량은 30일째까지 증가하다가 이후 다소 감소하였다(Table 2). 발효 40일째에는 우엉된장의 함량이 가장 높았고, 다음으로 대조구, 연근, 도라지된장이 높았다. 우엉된장의 총 phenolic acid 함량은 199.19 μg/g으로 대조구 79.49 μg/g의 2.5배나 높아, 우엉된장은 대조구보다 높은 생리기능성을 가질 것으로 사료되었다.

재래식 메주와 된장(Kim MH 등 1994)에서는 caffeic acid와 p-coumaric acid 함량이 높았고, Bacillus 균주를 달리하여 제조한 된장(Lee KH 등 2016)에서는 hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid 함량이 높았다. Aspergillus oryzae를 접종하여 제조한 개량식 된장(Lee JS & Cheigh HS 1997)에서는 syringic acid 함량이 가장 많았고, 다음은 vanillic acid, hydroxybenzoic acid의 순으로 높아 본 시료 된장제조에 사용한 개량메주와 유사하였으나, phenolic acid 조성과 함량에는 차이가 있었다. 여주 함유 된장에서는 7종의 phenolic acid가 검출되었는데(Hwang CE 등 2017), protocatechuic acid, chlorogenic acid 함량이 높다고 하여 선행 논문들과 다른 결과를 보였다. 이와 같은 결과는 원료 대두의 품종, 부재료 첨가, 재료된장의 제조 방법 등이 된장의 phenolic acid의 함량과 조성에 영향을 미쳤기 때문인 것으로 사료되었다.

Polyphenol은 과일, 채소, 차, 커피, 두류 등 식물성 식품에 널리 분포되어 있으며, 항암, 항산화, 혈압강하작용, 간장보호 효과 등을 갖는 식물의 2차 대사산물이다. 현재까지 8,000 여종 화합물이 알려져 있으며, 크게 phenolic acid, flavonoid, tannin, lignan, stilbene 등으로 분류된다(Khan H 등 2019).

뿌리채소 된장의 총 polyphenol 함량 변화 결과는 Fig. 3과 같다. 제조 당일에는 대조구가 11.65 mg/g으로 가장 높았고, 다음은 연근된장 10.50 mg/g > 도라지된장 9.87 mg/g, 더덕된장 9.32 mg/g > 우엉된장 9.21 mg/g 순으로 발효 기간이 경과함에 따라 증가하였다(p<0.05). 우엉된장의 경우, 총 polyphenol 함량은 제조 당일에는 가장 낮았으나, 이후 급격히 증가하여 발효 10일째부터 시료 된장 중 가장 높게 나타났다. 발효 40일째의 총 polyphenol 함량은 12.83∼14.55 mg/g이었고, 우엉, 연근된장이 유의적 차이 없이 가장 높았으며, 다음은 대조구가 높았고, 더덕과 도라지된장의 함량은 유사하였다(p<0.05). 된장의 총 polyphenol 함량은 발효숙성 과정 중 증가한다고 보고되었으며(Lee KH 등 2016), 발효 과정 중 미생물에 의해 대두로부터 phenol성 화합물이 분해되기 때문인 것으로 알려져 있다(Hwang CE 등 2017). 60일간 발효한 여주 함유 된장(Hwang CE 등 2017)의 총 polyphenol 함량은 13.49∼14.52 mg/g으로 본 시료 된장과 유사하였고, 8주 발효한 콩알메주 된장의 총 polyphenol 함량은 7.96∼9.65 mg/g으로 본 연구의 대조구 14.03 mg/g보다 낮았다(Jeong EJ 등 2018). 한편, 4종 시판 된장의 총 polyphenol 함량은 3.28∼4.47 mg/g의 범위로 대조구의 23∼32% 정도로 매우 낮았다(Kang KK 등 2016). 이상의 결과로부터 대두만을 원료로 하여 제조한 된장(Kang KK 등 2016; Jeong EJ 등 2018)의 총 polyphenol 함량도 원료대두, 제조 방법 등에 따라 차이가 크며, 된장의 총 polyphenol 함량을 증가시키기 위해서 우엉이나 연근의 첨가가 적절한 것을 알 수 있었다.

Fig. 3. 
Changes in total polyphenol content of doenjang added with root vegetable powder and control doenjang during fermentation at 30℃ for 40 days.

Control: doenjang without root vegetable powder, Deodeok: doenjang with deodeok powder, Balloon flower root: doenjang with balloon flower root powder, Burdock root: doenjang with burdock root powder, Lotus root: doenjang with lotus root power. Data are expressed as mean±S.D. (n=3). ^a∼d Means with different superscripts in the same fermentation time are significantly different at the p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Flavonoid 화합물은 polyphenol의 일종으로 식물의 잎, 줄기, 열매, 뿌리, 종자 등 식물의 모든 부위에 분포하며(Park JS 등 2002), 두 개의 phenyl 환에 탄소 3개의 환을 가지는 C6-C3-C6의 골격구조룰 가진다(Fan M 등 2019). Flavonoid 화합물에는 chalcone, flavone, flavanol, flavan 3,4-diol, proanthocyanidin, anthocyanin 등이 있으며, 식물체내에서는 자외선 차단, 병원체 방어 등 다양한 식물보호 기능이, 인체에서는 항균, 항염증, estrogen 작용, tyrosinase 저해 작용 및 강력한 항산화 활성을 가진다(Park JS 등 2002).

뿌리채소 된장의 총 flavonoid 함량 변화 결과는 Fig. 4와 같다. 제조 당일에는 우엉된장이 0.89 mg/g으로 가장 높았고, 다음은 도라지된장(0.76 mg/g), 더덕된장(0.73 mg/g)이 높았고, 이어서 연근된장(0.72 mg/g), 대조구(0.70 mg/g)의 순으로 나타났다. 발효기간이 경과함에 따라 모든 시료 된장의 총 flavonoid 함량은 증가하여 40일째에는 우엉된장(1.42 mg/g) > 연근된장(1.10 mg/g), 도라지된장(1.07 mg/g) > 대조구(1.05 mg/g) > 더덕된장(0.97 mg/g)의 순으로 나타났다(p<0.05). 특히, 우엉된장의 총 flavonoid 함량은 다른 된장보다 40일째까지 현저하게 증가하여 가장 높은 함량을 나타내었다.

Fig. 4. 
Changes in total flavonoid of doenjang added with root vegetable powder and control doenjang during fermentation at 30℃ for 40 days.

Control: doenjang without root vegetable powder, Deodeok: doenjang with deodeok powder, Balloon flower root: doenjang with balloon flower root powder, Burdock root: doenjang with burdock root powder, Lotus root: doenjang with lotus root power. Data are expressed as mean±S.D. (n=3). ^a∼c Means with different superscripts in the same fermentation time are significantly different at the p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Kang HJ 등(2016)은 유통 중의 전통된장, 저염된장, 개량식 된장을 된장별로 3개씩 구입하여 35℃에서 4주간 저장한 후, 총 flavonoid 함량을 측정한 결과, 각각 약 1 mg/g, 1 mg/g, 1.15 mg/g이라고 보고하였다. 이들 시판된장은 제조일자를 명확히 알 수 없고 제조 후 경과된 시일도 불명확하지만, 저장기간이 증가해도 산도 및 아미노태 질소 함량의 유의적 변화가 없어 발효는 끝났고 숙성과정 상태임을 예측할 수 있었다(Kang HJ 등 2016). 그러나 총 phenol 화합물과 총 flavonoid 함량은 저장기간이 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 본 시료된장은 40일간 발효한 숙성되지 않은 상태의 된장으로 상기 연구에 사용한 숙성 중의 유통된장보다 숙성기간은 짧지만 우엉된장을 제외한 시료된장의 총 flavonoid 함량에는 큰 차이가 없었다. 한편, 우엉된장의 총 flavonoid 함량은 1.42 mg/g으로 숙성이 진행 중인 다수의 유통된장보다 현저히 높은 것을 알 수 있었다. 된장의 발효 중 총 flavonoid 함량의 증가는 isoflavone의 배당체가 β–glucosidase에 의해 aglycone 형태인 genistein과 daidzein의 함량이 증가하기 때문인 것으로 알려져 있다(Kwon SH & Shon MY 2004). 이상의 결과, 우엉, 연근, 도라지분말을 된장 제조에 첨가 시 대조구에 비해 flavonoid 함량이 현저히 증가함에 따라 항산화 기능성이 높은 된장 제조가 가능할 것으로 사료된다.