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본 실험에 사용한 표고버섯(Lentinula edodes)은 충남 홍성군에서 생산 및 건조된 버섯을 구매하여 사용하였다.

표고버섯의 압출성형은 twin extruder(FX-40, Seoul, Korea)를 사용하였다. 압출성형기의 스크루 직경은 44∅, 직경과 길이의 비(L/D ratio)는 20:1이다. 표고버섯 압출성형의 변수로는 메인 스크루 1,200 rpm, 원료 feeder 25 rpm, 수분공급량 100 cc/min, barrel 1의 온도 80℃, barrel 2의 온도 100℃, barrel 3의 온도 120℃로 설정하였다. 표고버섯 시료는 이물질 제거 및 흐르는 물로 세척하였으며, 25~30℃에서 24시간 냉풍 건조하였다. 건조된 표고버섯은 cutter mill을 이용하여 분쇄한 후 180 μm pore size의 80 mesh 표준체(Testing sieve, Chung-gye Sanggong Co., Seoul, Korea)를 통과한 분말을 사용하였다. 표고버섯 및 압출성형한 표고버섯 100 g에 증류수 10.7배를 가한 뒤 60℃에서 24시간 교반 추출하였으며, 6,000 rpm에서 30분 원심분리하고 분리된 상등액은 여과지(Advantec Toyo 5A, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 사용하여 감압 여과한 뒤 동결건조기(BD8512, Ilshin Lab. Co. Ltd., Korea)로 건조하여 실험에 사용하였다.

표고버섯의 β-glucan 함량은 Choi SJ 등(2010)의 방법을 이용하여 Megazyme kit(Mushroom and Yeast β-glucan Assay Procedure K-YBGL, Megazyme, Ireland)로 측정하였다. 총 glucan 함량 측정은 150 μm pore size의 100 mesh 체로 시료를 거른 분말 100 mg을 37% HCl 1.5 mL에 넣고 30℃에서 45분간 가열하여 분해하였다. 가열 후 증류수 10 mL를 넣고, 100℃에서 2시간 가열하였다. 가열 후 실온에서 방냉하고 2 N KOH 10 mL에 200 mM sodium acetate buffer로 100 mL를 정용하였다. 상등액 0.1 mL에 효소 혼합액 (exo-1,3-β-glucanase (20 U/mL) + β-glucosidase (4 U/mL)) 0.1 mL를 혼합하였다.

Reagent blank는 acetate buffer 0.2 mL를 넣고, D-glucose standard는 D-glucose standard 0.1 mL와 acetate buffer 0.1 mL를 넣고 g혼합한 후 40℃에서 60분 동안 반응시켰다. Glucose oxidase/peroxidase mixture(GOPOD) 3 mL를 넣고 40℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-Glucan은 100 mesh 체로 시료를 거르고, 100 mg에 2 M KOH 2 mL씩 넣고 20분간 혼합하였다. 1.2 M sodium acetate buffer 8 mL를 넣고 섞은 후 효소 혼합액 (amyloglucosidase (1,630 U/mL) + invertase (500 U/mL)) 0.2 mL를 넣고, 잘 섞어서 40℃에서 30분간 반응시켰다. 상등액 0.1 mL에 200 mM sodium acetate buffer 0.1 mL, GOPOD 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 반응시킨 후, UV/vis spectrophotometer(Opiwen 2120 UV plus, Mecasys Co. Ltd., Korea)를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. β- Glucan의 함량은 total glucan 함량에서 α-glucan 함량을 빼서 정량하였다.

총 폴리페놀 함량은 Kim JM 등(2010)의 방법을 이용하여 측정하였다. 증류수 4.8 mL에 시료 0.2 mL, 1 N Folin-Ciocalteau’s phenol(Sigma, St Louis, Missouri, USA) 0.5 mL를 혼합하여 3분간실온에서반응시킨후10% Na₂CO₃ 1 mL를첨가하여 1시간동안 반응시키고 UV/vis spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 증류수를 사용하였으며, 총 폴리페놀 화합물의 함량은 gallic acid(Sigma, St Louis, Missouri, USA) 검량선에 의하여 산출하였다.

총 플라보노이드 함량은 Moreno MI 등(2000)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 0.5 mL에 80% ethanol 4.3 mL, 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL를 혼합한 뒤 실온에서 40분간 반응시키고, UV/vis spectrophotometer를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 증류수를 사용하였으며, 플라보노이드 화합물의 함량은 quercetin(Wako, Osaka, Japan) 검량선에 의하여 산출하였다.

DPPH radical 소거능은 Blois MS(1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료와 양성대조군인 ascorbic acid는 농도별로 증류수에 녹였으며, DPPH(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)는 ethanol에 0.15 mM 농도로 녹여서 사용하였다. 시료 0.2 mL에 DPPH 0.6 mL를 첨가하여 암조건에서 30분간 반응시킨 후 UV/vis spectrophotometer를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 증류수를 사용하였으며, 다음 계산식에 의거하여 소거활성을 측정하였다.

DPPH radical 소거능(%) = 100 — [(Absorbance value of sample / Absorbance value of control) × 100]

환원력은 Arabshahi-Delouee S & Urooj A(2007)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 및 시약은 증류수에 용해하여 실험에 사용하였다. 시료 0.5 mL에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 0.5 mL, 1% potassium ferricyanide 0.5 mL를 혼합하고 50℃에서 20분 동안 반응시킨 후 10% trichloroacetic acid 2.5 mL를 가하였다. 반응액은 650 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 상층액 0.5 mL에 증류수 0.5 mL, 1% iron(III) chloride 0.1 mL를 가하여 혼합한 반응액의 흡광도는 UV/vis spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 증류수를 사용하였으며, 측정되는 흡광도로 환원력 정도를 평가하였다.

마우스 단핵구 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin/streptomycin(PEST)을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 공기조건으로 배양하였다(Denlinger LC 등 1996). RAW 264.7 세포가 70% 이상 배양되면 cell scraper를 이용하여 세포를 모아 1,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 계대배양을 실시하였다.

세포 내 nitric oxide 생성량 측정은 Denlinger LC 등(1996)의 방법으로 측정하였다. RAW 264.7 cell을 24 well에 1 × 10⁵ cell로 분주하고 24시간 동안 배양한 다음 표고버섯 추출물을 처리하였으며, 양성대조군으로 lipopolysaccharide(LPS) (Sigma, St Louis, Missouri, USA)를 세포에 1 μg/mL 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 24 시간 배양 후, 세포 배양액 100 μL와 동량의 Griess reagent를 첨가한 뒤 15분 동안 실온에서 반응시켰으며, UV/vis spectrophotometer를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 사용하지 않은 배지를 사용하여 측정하였다.

통계처리는 SAS(statistical analysis system) 9.4(SAS institute, NC, USA) 을 사용하여 각각의 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었으며, 각 군의 평균치의 통계적 유의성을 p<0.05 수준에서 ANOVA test 및 Duncan's multiple range test로 사후분석 후 유의성을 검정하였다.

표고버섯과 압출성형 표고버섯 추출물의 β-glucan 함량을 비교한 결과는 Table 1과 같다. 표고버섯의 β-glucan 함량은 196.92 mg/g, 압출성형 표고버섯의 β-glucan 함량은 221.87 mg/g으로 압출성형을 통해 β-glucan 함량이 약 112.6% 증가하는 것이 확인되었다. β-Glucan은 식물과 버섯류의 세포벽을 구성하며 단백질 또는 기타 세포벽 성분과 결합한 형태로 존재하며 면역 활성, 항산화 작용, 생체조직의 재생, 항생작용, 항균작용 및 항바이러스 작용, 항종양 효과가 보고되었다(Mizuno M 등 1998). Choi SJ 등(2010)은 표고버섯물 추출물의 β-glucan 함량이 335 mg/g이라고 보고하였으며, Kim KJ & Seo KS(2016)는 종에 따른 표고버섯 β-glucan 함량이 157.0~317.4 mg/g으로 본 연구에서는 다른 연구결과보다 다소 낮은 β-glucan 함량을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

Ballance GM & Manners DJ(1978)는 수삼을 압출성형하였을 때 수분 및 온도, 전단력에 의해 섬유소 증가에 의한 추출 수율 증가를 보고하였으며. Jung EB 등(2008)의 압출성형 곡류와 Hong JH 등(2004)의 압출성형 콩 비지에 관한 연구에서 수용성 섬유소와 환원당 증가를 보고하였다. 또한, Gil SK 등(2016)은 수분함량과 배럴 온도를 달리한 압출성형에서 신령버섯의 β-glucan 함량이 증가함을 보고하였다. 이와 같이 표고버섯을 압출성형 하였을 시 표고버섯에 가해지는 온도 및 압력 등을 통한 세포벽의 파괴로 인한 용출 증가로 표고버섯의 β- glucan 함량이 증가한 것으로 판단된다.

표고버섯과 압출성형 표고버섯 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 Fig. 1과 같다. 표고버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량은 50.51±10.96 GAE/g, 플라보노이드 함량은 8.59±2.86 QE/g으로 확인되었으며, 압출성형 표고버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량은 63.37±2.68 GAE/g, 플라보노이드 함량은 13.12±2.11 QE/g으로 압출성형에 따른 총 폴리페놀 함량이 125.46% 증가하였으며, 플라보노이드 함량이 153.74% 증가함이 확인되었다.

Fig. 1. 
Total ployphenol and flavonoid contents of normal Lentinula edodes (NLE) and extrusion Lentinula edodes extract (ELE).

The total polyphenol and flavonoid contents were expressed as mg of gallic acid equivalents (GAE) and quercetin equivalents (QE) per g of dry extract.

Data were expressed as mean±S.D. and comparisons of data were conducted using one-way ANOVA.

* p<0.05, compared to normal Lentinula edodes (NLE).

식물에 포함된 폴리페놀은 플라보노이드, 안토시아닌, 탄닌, 카테킨, 리그난 등이 있으며, 항산화 작용 및 항암작용, 항염 작용 등의 효과가 있음이 보고되어 있다(An BJ 등 2002; Ahmad N 등 2000). Sung NY 등(2016)은 압출성형시 온도 및 스크루 속도에 따른 무청의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가함을 보고하였으며, Schmidtlein H & Herrmann K(1975)는 인삼의 압출성형 과정에서 온도 증가로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가하는 것을 보고하였다. 이와 같이 압출성형 과정에서 압출성형에 의한 표고버섯의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 증가는 압출성형 시 표고버섯에 가해지는 열과 스크루에 의한 조직 연화 및 용출증가에 의한 결과인 것으로 판단된다.

표고버섯과 압출성형 표고버섯 추출물의 DPPH radical scavenging activity는 Fig. 2와 같다. 표고버섯 추출물과 압출성형 표고버섯은 농도가 증가함에 따라 DPPH radical scavenging activity가 증가하였으나, 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid보다는 낮은 활성을 나타내는 것이 확인되었다. 표고버섯 추출물 0.5 mg/mL 처리시 20.6%, 1 mg/mL 처리시 32.7%의 DPPH radical scavenging activity를 나타내었으며, 압출성형 표고버섯 추출물 0.5 mg/mL 처리시 27.9%, 1 mg/mL 처리시 42.4%의 DPPH radical scavenging activity가 확인되었다.

Fig. 2. 
DPPH radical scavenging activity of normal Lentinula edodes (NLE) and extrusion Lentinula edodes extract (ELE).

Values expressed are mean±S.D. of triplicate measurements.

^a~d Mean is a row by different superscippts are significantyl at p<0.05.

Values with different superscripts on the bar are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

DPPH는 안전한 구조의 free radical로 보라색을 나타내며,

항산화 활성을 가진 물질과 반응하면 환원되어 보라색이 노란색으로 전환되기 때문에 측정하고자 하는 시료가 가지는 전자공여능을 확인할 수 있다(Kang YH 등 1995). Son HJ & Ryu GH(2009)와 An SH & Ryu GH 등(2015)의 연구에서 압출성형에 의해 DPPH radical scavenging activity가 증가함을 보고하였으며, 이러한 증가는 압출성형에 의해 phenolic acids, flavonoids 및 기타 페놀성 화합물 증가에 의한 DPPH radical scavenging activity가 증가하는 것으로 보고하였다. 실험결과 압출성형을 통해 표고버섯의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가하는 것이 확인되었으며, 압출성형을 통해 표고버섯 내 phenolic acids, flavonoids 및 기타 페놀성 화합물 증가에 의해 DPPH radical scavenging activity가 더 많이 증가한 것으로 판단된다.

표고버섯과 압출성형 표고버섯 추출물의 환원력은 Fig. 3과 같다. 표고버섯 추출물 0.5 mg/mL의 환원력은 0.20±0.06, 압출성형 표고버섯 추출물 0.5 mg/mL의 환원력은 0.25±0.05로 125% 증가가 확인되었으며, 표고버섯 추출물 1 mg/mL의 환원력은 0.38±0.03, 압출성형 표고버섯 추출물 1 mg/mL의 환원력은 0.43±0.02로 113.16% 증가함이 확인되었다.

Fig. 3. 
Reducing Power of normal Lentinula edodes (NLE) and extrusion Lentinula edodes extract (ELE).

Values expressed are mean±S.D. of triplicate measurements.

^a~e Mean is a row by different superscippts are significantyl at p<0.05.

Values with different superscripts on the bar are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

환원력은 ROS에 전자를 제공할 수 있는 활성 수소를 흡광도 수준으로 측정한 값으로 ferric-ferricyanide(Fe³⁺) 혼합물이 수소를 공여하여 유리라디칼을 안정화 형태인 ferrous(Fe²⁺)로 환원시키는 활성을 알아보는 실험으로 흡광도가 높을수록 높은 환원력을 의미한다. Choi KH 등(2014)의 실험과 Gui Y& Ryu GH(2014)의 실험에서 압출성형에 의해 환원력이 증가함을 보고하였다. 이러한 환원력의 증가는 압출성형에 의해 페놀성 화합물 및 다당류 용출이 증가하여 나타나는 결과인 것으로 판단하였으며, 본 실험결과 표고버섯의 환원력 증가 역시 압출성형에 의한 총 폴리페놀과 플라보노이드 등의 성분 증가에 의한 증가로 판단된다.

Raw 264.7 세포에서 표고버섯 및 압출성형 표고버섯 추출물에 의한 nitric oxide(NO) 생성량은 Fig. 4와 같다. 무처리군의 NO 생성량을 100%로 환산하였을 시 lipopolysaccharide(LPS) 1 μg/mL를 처리한 군의 NO 생성량은 197.4% 증가하였다. 표고버섯 추출물 0.5 mg/mL 처리시 133.9%, 1 mg/mL 처리시 141.1%로 NO 생성량이 증가하였으며, 압출성형 표고버섯 추출물 0.5 mg/mL 처리시 141.1%, 1 mg/mL 처리시 168.1%로 NO 생성량 증가로 압출성형 표고버섯의 NO 생성량이 증가하는 것이 확인되었다.

Fig. 4. 
Effects of the normal Lentinula edodes (NLE) and extrusion Lentinula edodes extract (ELE) on nitric oxide production in RAW 264.7 cells.

Cells were treated with lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL).

Values expressed are mean±S.D. of triplicate measurements.

^a~d Mean is a row by different superscippts are significantyl at p<0.05.

Values with different superscripts on the bar are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

Nitric oxide(NO)는 nitric oxide synthase(NOS)의 효소 촉매 작용을 통해 생성되는 라디칼로 혈압조절, 신경전달 매개체 및 면역반응을 조절한다(Palmer RMJ 등 1988). NOS는 염증 반응시 생성되며, 대식세포, 내피세포 등에 작용하여 다량의 NO 생성을 유도하고, 혈관 확장과 생체 면역반응을 촉진하는 것으로 보고되었다(Kawamata H 등 2000; Seo WG 등 2010). 세포 내 NO 생성량 증가는 면역반응의 증가를 의미하며, 표고버섯 및 압출성형 표고버섯 추출물은 NO를 증가시킬 수 있음이 확인되었다. 실험결과를 통해 면역반응을 증가시키는 LPS보다 낮은 NO 생성량을 나타내었지만, 인체 적용이 불가능한 LPS와 달리 식용으로 사용이 가능한 표고버섯을 통해 면역반응 증가제로의 활용이 가능할 것으로 판단된다.